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干货小黑板—耦联染料知多少？
2795 人阅读发布时间：2021-02-05 12:02
无独有“耦” “联”连不断
耦联染料小讲堂
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耦联染料的产生背景
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什么是耦联染料
耦联染料采用的是荧光能量共振转移（FRET）的原理。荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基团（受体 Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100Å），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即当前一种基团被激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光[1]。以下图中PE-Cy7的信号产生为例：PE（供体染料）吸收激发光信号之后，产生了对应的发射光谱；当Cy7荧光靠近PE时，就会吸收PE的发射光谱，从而产生Cy7的荧光信号。
常见的耦联染料可以根据染料名称（带“-”）进行分辨，但随着BV系列聚合物染料的出现，这种命名方式也不再呈现。一些染料，包括BV570、BV605、BV650、BV711和BV786，尽管它们的名称中没有表示这种状态，但实际上这些BV染料本质上是耦联染料。这些聚合物染料有两种形式，一种是碱性聚合物，另一种是耦联聚合物。如上图中的BV421耦联Cy3，产生BV570信号[2]。
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耦联染料的使用挑战
能量共振转移效率取决于供体和受体荧光基团之间的距离，所以这些人造染料必须远离自由基环境的影响，否则会导致耦联染料解耦和分解的现象。光照、温度变化和固定剂都是自由基产生的主要来源，同时也提醒我们在样本制备的过程要小心处理。
考虑到在实验时使用耦联染料多少会遇到一些挑战，在这里我们通过Cytek Aurora光谱流式细胞仪更加直观地表现染料的属性和质量：
1.我的染料是否降解了？
光照、处理、储存条件和培养基对偶然染料稳定性的影响已经得到了大量的数据证明。例如，Cy7结合的PE和APC荧光基团可以在光、氧或组织固定化学物质[3][4][5]的作用下降解，导致耦联染料信号强度的损失，以及在供体荧光基团的检测器中引入额外的荧光溢漏。Cytek的全光谱通过荧光扫描方式，可以很容易地确定降解情况。例如，BV785染料在持续光照下出现了明显的BV421光谱信息，导致数据不正确。
2.CD4单标可以应用于所有的单标吗？
与非耦联染料相比，用不同抗体标记的耦联染料可能会呈现出不同的光谱特征。我们对Percp-eFluo710的多个抗体单标进行了光谱拟合后，发现了它们之间的差异。而BV421的多个单标光谱拟合后保持一致。我们的研究结果表明，PE、Percp和APC串联染料的拟合光谱经常存在差异。当存在差异时，光谱解析后也会有些许补偿的调整。
3.批次之间的差异：
由于制造的原因，供体和受体分子的数量在不同批次之间可能略有不同。研究报告称，APC-H7和APC-Cy750在批次之间的差异明显大于APC [6]。除关注这些信息之外，我们还需要了解不同货号的耦联抗体产生抗体聚合物的情况也不一样（如下图）。当我们在遇到抗体聚合物的情况下，可以将整瓶抗体高速离心（10000g,5min）后使用。
4.非特异性结合：
大多数串联染料产品有一个独特且不受欢迎的特性，就是与单核细胞的低水平“非特异性”结合（主要是Cy5,Cy7, Texas Red）。这种非特异性染色的水平在不同染料和不同供应商之间差异很大[1]。减少这种与单核细胞的非特异性结合，可以使用部分厂家（如Biolegend）提供的单核细胞阻断剂。
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如何得知是耦联还是非耦联
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总结
耦联染料是多色流式发展进程中的重要物质，而光谱流式是获取荧光染料信息的重要途径。在这里，我们介绍了何为耦合染料以及使用的注意事项，希望可以对您的实验有更多的帮助。如果想更多的了解Cytek 全光谱技术，您可以通过以下途径：登陆Cytek官方网站、关注微信公众号、联系当地的销售技术人员。
//参考文献
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