光谱流式客户应用方案分享----评估一个 25 marker肿瘤免疫监测方案的分析性能

在Cyto 2020上，来自美国Merck公司转化分子生物标记物实验室的Holly Jensen等研究者，发表了一篇题为’ Analytical Performance Characteristics of a 25-Parameter Spectral Cytometry Panel in Peripheral Blood for Immune Monitoring Biomarker Applications’ 的海报，详细介绍了一个 25 marker（3激光24色）肿瘤免疫监测方案的分析性能。研究者从不同的角度进行了详细的阐述，对于那些有多色方案设计需求，尤其是肿瘤免疫方向的用户，这个方案可谓有很大的参考和借鉴价值！

然而，开发一个强大的免疫表型研究方案在转化和临床领域仍然面临着许多挑战。基于传统流式的方案，受可行性和可重复检测性能的限制，通常局限在5-10色。而光谱流式的出现，大大提升了单管可检测标记的数量，为制定和推行标准化的免疫监测多色方案提供了强大的工具！

我们首先介绍25种生物标志物的方案设计。为了实现高维多参数的免疫表型分析，同时提高试剂、样本及操作效率，研究者在Cytek Aurora光谱流式细胞仪（3激光系统）上，率先进行了多色方案设计，开发了一个包含25种生物标志物的广泛适用的免疫监测方案，用于健康和患病患者外周血中的免疫细胞变化的监测。

值得指出的是，方案中CD3和CD15均选择了AF488的荧光素搭配，而经光谱特征相似性验证发现，对于这两个标记的解析，仅需录入一个参考对照即可满足。

研究者还发现，CD14+细胞亚群受细胞自发荧光影响较大，去除自发荧光可以帮助更好的鉴定这群细胞，光谱流式独有的提取自发荧光功能在这里起到了很大的贡献。

 分级设门策略采用59个门和27个二位点图（在清除碎片后，鉴别黏连体，及Live/Dead和CD45 +门之后）。下图显示的是裂解红细胞的外周血样品。除了高密度粒细胞门以外，可以将相同的设门策略应用于PBMC样本。

通过下面所示的树状逻辑图，能够更清晰的了解研究者的设门思路和策略。

对于超过20色的方案，样本和试剂的经济性是需要考虑的问题，荧光减一（Fluor-minus-one，FMO）对照就变得很棘手。而本文研究者采用荧光减多（Fluor-minus-multiple, FMM）对照，以确保在应用上述设门策略时正确的细胞分群。初级系别标记（CD4，CD19，CD8，CD3，CD45和Zombie NIR）因能清晰分群而不需要纳入FMM对照。研究者设计了三个平行的FMM对照方案，每个方案去掉6-7个标记。在分配缺席标记时，考虑了以下因素：邻近的荧光素被分隔开，形成“local FMOs”，同时维持二位点图中使用缺席标记进行分群的组合（如CCR4 BV605与CCR6BV785），最后，公平的将激活标记（CD25，HLADR）分配至三个FMM中。

研究者通过检测6名健康供体的外周血，展示了方案的批内精度，以及在供体中的纵向变化。

如下图所示，研究者将来自健康供者的检测值进行平均，用每个圈门的细胞群的批内变异系数（％CV）与平均细胞计数作图，发现对于全血分析，除CD14-HLADR-CD33+CD11b+（e-MDSC）群体因计数较低而%CV> 20％外，其他细胞群体的%CV均 <20％。而对于PBMC，仅冷冻保存后的PBMC检测的CD14- HLADR-细胞群%CV> 20%。

研究者比较了来自相同的五名健康供体间隔14天的血液样本，以评估供体内纵向变异性。从下图示例的6个细胞群可以看出，来自每个供体的两个采集时间点之间仅有较小的免疫波动。

最后研究者总结，基于3激光的Cytek Aurora平台，他们成功开发了一个25免疫生物标志物检测方案。该方案可使用27个二维点图手动分析，且只需要3个FMM对照辅助。除外低计数细胞群（例如CD14-HLADRCD11b + CD33 +），批内分析精度可达到%CV<20%。研究者的下一个工作目标，包括更高阶的分析工作流程，以及将方案扩展至5激光的Cytek Aurora系统。