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光谱流式奇妙之旅---不用荧光染料也做漂亮实验
855 人阅读发布时间：2021-12-07 13:59
利用 Cytek 的 全光谱分析（ Full Spectrum Profiling™, FSP™ ）技术，AF 信号可被视为一种单独的信号，被仪器轻松的识别和处理。光谱流式独有的这项强大的功能，使得高自发荧光样本更加易于探索和使用。借助这一功能，您可以比较不同细胞类型、微生物类型等的 AF 特征。此外，一旦您确定了样本的 AF 特性，就可以使用此信息设计更高质量的方案。
我们曾经报道过去除自发荧光，获取高质量实验数据的应用案例 - 看不见就不存在吗？——巧用自发荧光提取，扭转实验结果！
今天，我们一起再来看一个不用任何荧光染料，仅利用细菌自身的自发荧光，进行细胞亚群鉴别的实验---光谱流式鉴别化学处理后的铜绿微囊藻细胞亚群
研究背景
铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）是一种存在于内陆湖泊、溪流和水源中的蓝细菌。
蓝细菌可以形成有害的藻类水华，包括微囊藻毒素和类毒素等，这些有害的化合物会造成水污染，危害人类和动物的健康。一般情况下，控制水中蓝细菌，需要快速的化学处理方法，以确保有害的蓝藻物种能从水中被迅速清除。
蓝细菌通常含有不同的光合色素-藻胆体（phycobilisomes），它们可以吸收所有波长的激光—其发射光最长可至660 nm。利用其高自发荧光的特性，我们可以将其在光谱流式上轻松的进行鉴别。
图1-叶绿素(A)和藻胆体(B)的吸收光谱示意图
(Chlorophyll a-叶绿素 a，Chlorophyll b-叶绿素 b，
Phycocyanin-藻青蛋白，Phycoerythrin-藻红蛋白)
实验设计
研究者通过BG-11培养基在实验室中培养微囊藻，并监测两种情况下的生长情况：1）培养基养分耗尽，2）化学处理后。
化学处理：使用不同浓度的 H2O2、CuSO4 和 KMnO4处理微囊藻培养物，并监测处理后2-4小时、1天、2天、和7天的培养物的光谱变化及细胞紊乱情况。
主要方法
细胞培养：蓝细菌细胞培养，微胞藻属绿脓杆菌培养，BG-11 培养基
化学处理：H2O2、CuSO4 和 KMnO4
监测时间节点：4 小时, 1,2,10 days
仪器：Cytek Aurora 全光谱流式细胞仪- 4 激光- 48 个荧光通道3 个散射光。实验中对蓝细菌的监测均采用Cytek Aurora完成。
Cytek™️ Aurora 全光谱流式细胞仪
研究结论
研究者利用蓝细菌自身的荧光特征，建立紫激光V7（542nm）和黄绿激光YG4（660nm）的二维点图，清晰分辨出蓝细菌在不同生长状态下的细胞亚群。如下方图2所示，P2表示健康状态下的细胞。当细胞在横轴上的信号变强，纵轴逐渐变弱，则提示细胞出现紊乱状态（P3-P5）。随着横轴和纵轴荧光信号的全部丢失，则意味着细胞发生了死亡（P6）。（图2）
从图2右侧的P1-P5的光谱图也可看出，不同状态下的细胞亚群，其光谱特征是存在明显差异的。
图2- 蓝细菌在BG-11营养缺乏培养基中的生长
A) 铜绿微囊藻的各个亚群的二维点图。P1 显示全部细胞群的发射光谱，P2-P5 显示各个圈门中各亚群的发射光谱。
B) 具有代表性的直方图，突出显示V7 和YG4中的光谱变化。
注：P2-细胞健康，P3-紊乱细胞，P4和P5死亡中的细胞，P6死亡细胞。P4&P5&P6-在显微镜下观察到降低了光合荧光。
研究者同时发现，蓝细菌对化学处理物呈现剂量和时间依赖效应，从图3可以看出，KMnO4浓度越高，蓝细菌向紊乱状态和死亡转化的比例越高（图3）。这种情况也随着时间的推移而严重（图4）。
图3- KMnO₄ (5,10, 25, 50,100 ug/ml)处理4小时后
从上图可见，随着KMnO₄浓度的增加，细胞从正常状态（P6）转化为紊乱（P7）和死亡状态的比例也随之增加。
图4- 比较分别用 H₂O₂, CuSO₄ 和 KMnO₄处理26小时
从上图可见，相较于对照组，化学物处理各组在处理26小时后，均表现出不同程度的细胞紊乱（P7），并逐渐向死亡状态过渡（P8-P14）。
这些研究数据，为研究人员寻找适当的快速处理水污染的方法提供了依据，帮助他们更好的治理水污染。
研究者同时认为，Cytek Aurora 全光谱流式细胞仪--4激光配置 (405, 488, 550, and 633 nm) 48 荧光检测通道，可以提供优秀的系统分辨率，为本研究的关键数据收集和分析提供了非常重要的帮助。
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