Cytek全光谱流式新玩法，实时解析活细胞内荧光共振能量转移（FRET）

荧光共振能量转移（FRET）是一种在特定条件下（供体荧光分子发射光谱与受体荧光分子吸收光谱重叠、染料分子偶极匹配），两个距离相近的荧光分子发生的非辐射能量转移现象。流式领域中常用的复合染料（如PE-Cy5）便是利用这种现象得到更大的斯托克斯位移，让我们的多色实验具有更多染料选择。但在更多的生物学家眼中，利用其近程效应，可将能够发生FRET的染料组设计成“分子尺”，通过染料组FRET程度的测定（供体分子的荧光猝灭和受体分子的荧光增强），监测细胞内蛋白相互作用、分析信号转导通路等。

图1. FRET“分子尺”工作原理

流式细胞术作为一种快速、灵敏、多参数的单细胞检测手段为细胞内FRET分析提供了一种高通量的表征方法。但传统流式受到带通检测方式的限制，须通过大量的后期数据处理方可获得细胞内染料组FRET效率。后续的处理流程使得传统流式无法完成FRET在线解析，且检测结果受仪器条件影响大、解析线性程度低，难以推广。

图2. 传统流式FRET检测计算方法，其中E为FRET效率

美国德克萨斯大学安德森癌症中心Henderson等人利用Cytek Aurora全光谱流式开发了一种无须复杂数据处理的活细胞FRET解析方法，得益于SpectroFlo软件实时光谱拆分与自发荧光提取功能，仅需利用low-FRET、high-FRET及阴性样本建立补偿库，即可实现活细胞内FRET在线检测。（图3）由于仪器很棒的稳定性，补偿库一经建立便可长期使用。

图3. 全光谱流式FRET解析补偿库设置

图4. 全光谱流式具有很棒的FRET实时分辨效果

在精准FRET在线解析的同时，Cytek Aurora全光谱流式强大的多色分辨能力得以让研究人员对实验体系中实现更多指标的同步分析。文章中，研究人员结合AKT蛋白磷酸化FRET报告体系以及细胞表面（(IgM、CXCR4、CD19）与胞内（SYK、 AKT、PTEN）染色实验，验证了报告体系中FRET与基因敲除实验中向导RNA（gRNA）成功导入的相关性。（图5）作者还在文中重点指出，如使用全光谱流式分选仪，便可在该FRET报告体系下完成gRNA文库的筛选。

图5. 全光谱流式FRET解析可用于判定基因调节AKT激活