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公司新闻/正文
硬核流式操作指南：抗体滴定，看似繁琐但很必要
4851 人阅读发布时间：2022-02-14 10:41
图1. 通过抗体滴定选择最佳染色浓度
抗体滴定是流式多色实验的必要流程
图2. 通过抗体滴定工作曲线选定最佳染色浓度
抗体滴定操作流程1
1.准备5 mL细胞浓度为5×106 cells/mL的PBMC样本，重悬于含有2% FBS的PBS中。
2.按样本设置（以图3为例），向流式管（或孔板）中加入100 μL细胞悬液。此时每个流式管/孔中含有5×105个细胞。注：抗体滴定需在荧光补偿后进行，因此示例中包含单染对照。
图3. 抗体滴定样本管设置示例
3.300-500 g，4℃离心5 min，去除上清，如细胞活性较低，需在此步对样本进行死活染色。
4.染色结束后离心弃上清，加入100 μL 稀释的Fcblock试剂，4℃孵育10 min后离心弃上清。
5.对抗体储存液进行离心，去除抗体聚合物（16000-18000 g，4℃，5 min），使用时吸取上清即可。
6.制备抗体滴定梯度稀释工作液，示例中给出的稀释梯度为1:50-1:1600。通常建议抗体初始浓度为试剂厂商推荐浓度或10 μg/mL，并以1:2或1:3的梯度逐级稀释抗体，记录每管/孔的抗体浓度。每种体需根据实验需求设置5-8个浓度梯度。
7.向样本管中加入100 μL对应浓度的稀释抗体，并加入100 μL FACS Staining缓冲液。阴性对照样本中仅加入200 μL FACS Staining缓冲液。
8.按实验组常用的染色条件进行抗体孵育及清洗，最终重悬至200 μL FACS Staining缓冲液。如实验组样本需固定破膜，滴定组样本处理流程应与实验组保持一致。
9.使用流式细胞仪在荧光补偿/光谱解析后的实验模板中采集样本，并计算每管/孔样本的染色指数(SI)，SI=(MdnFIpos-MdnFIneg) / (2×SDneg)，以不引起阴性样本信号明显增加且SI最大的抗体浓度作为最佳抗体染色浓度。
注意事项1-4
2.抗体滴定是对抗体浓度的滴定，当扩大染色体系（体积增大）时，应同时增加抗体加入量，保持染色浓度不变。
3.当染色体系不变，但细胞量增加时（如增加10-50倍），无需增大抗体用量，保持滴定所得最佳浓度即可。
4.文中Protocol的滴定体系为200 μL，也可根据实验需求扩大或缩小体系。
5.当细胞表达Fc受体时（如NK、巨噬细胞、肥大细胞及中性粒细胞），需加入Fc阻断剂降后进行滴定。
6.细胞活性较低时，需在抗体滴定过程中加入死活染料，排除死细胞干扰。
7.如条件允许，为确保抗体在特定细胞类群的准确滴定，可借助谱系标记（如CD3、CD16、CD56等）预染细胞后进行滴定。
图4. 借助谱系标记预染后进行抗体滴定
8.抗体滴定中需存在阴性细胞群体，在一些特殊无阴性群的情况下（如对细胞系共表达抗原的研究），如条件允许可通过添加相似且无目标抗原的细胞作为阴性信号。.9
对于连续表达的样本，阳性信号很难准确圈定，此时仅能通过对散点图的观察判定最佳染色条件。与可视化的判定方法相比，通过SI与背景信号提升进行判断更为推荐。
图5. 连续表达样本抗体滴定最佳浓度选择
10.阳性信号过强时，在无法调整染色方案的情况下，可根据滴定曲线选择不影响分群效果的较低抗体用量，降低该染料对其他检测通道的干扰。
11.如条件允许，与免疫激活或耗竭相关的标志物（如CD39、CD69、CD137、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3）需在体外激活后进行抗体滴定。
图6. 使用PHA-L激活后获得更易区分的阳性信号
参考文献
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