Big Panel Theory系列之-3激光19色（20标记）CAR-T细胞治疗监测方案

研究背景

嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor, CAR）T细胞治疗被认为是肿瘤免疫治疗的重大科学突破。过继CAR-T细胞治疗在血液肿瘤的成功激励了研究人员将适应症扩展到更为广泛的领域，如实体肿瘤、自身免疫和传染病等。影响CAR-T治疗疗效和反应持久性的最重要因素是该细胞亚群的增殖和持久性，因此，许多检测方法被开发并用于检测和监测外周循环中的CAR-T细胞，诸如定量PCR (qPCR)或流式细胞术。

 

本文研究者指出，相较于qPCR等常规的CAR-T定量检测手段，流式细胞术允许对CAR-T细胞进行功能评价（如CAR的实际表达情况），并且，利用流式细胞术还可以确定CAR-T细胞的免疫表型，评价CD4/CD8比值、CAR-T细胞的成熟阶段、以及耗竭标志物 （PD1, LAG3和TIM3）的表达（图1），这些都是影响CAR-T疗效持久性和长期效应的重要评价指标。  为了监测CAR-T细胞治疗后患者外周血循环细胞的免疫改变，研究者利用Cytek全光谱流式细胞仪，设计了一个多参数的流式细胞方案，并对方案进行了评价。

 

图1- CAR-T细胞共刺激和共抑制标记

 

 - 研究方法 - 

3激光配置的Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪，拥有38个荧光检测通道，可以检测20色以上的多色方案，并且提供高灵敏的检测数据。来自根特大学医院的研究者基于3激光Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪，设计了一个19色（20检测标记）Car-T细胞治疗监测方案（表1），方案纳入了CAR-T细胞检测、T细胞成熟、耗竭标记、B细胞发育、单核细胞标记多共20个分子标记，各标记选择的荧光素和具体目的等信息可参考下方表1。

 

表1-3激光19色（20标记）CAR-T细胞治疗监测方案详细信息

 

研究者充分考虑了不同荧光素的相似度、溢漏表现、染色指数、及多色方案的复杂度指数，并结合不同标记的共表达等因素进行综合考虑，最终完成了方案的设计和优化。Cytek可提供多种工具帮助用户轻松进行方案的设计与优化，使用Cytek Spectrum Viewer 可对不同荧光素的相似度和方案复杂度进行评估。本文中的19色方案在Cytek Spectrum Viewer 中显示的复杂度指数仅为7.49（图2），表明研究者在方案中使用的各荧光素相互干扰小，是一个比较理想的多色方案。

 

图2-19色CAR-T方案复杂度指数

 

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 - 数据表现 - 

研究者将方案用于治疗患者的外周血样本进行检测，证实了此19色方案可以非常清晰的对CAR-T细胞进行鉴定及进一步的 免疫分型。（图3）

 

图2-Car-T细胞治疗方案数据结果示例

 

总    结

研究者基于3激光光谱流式，建立并评价了一个单管19色20标记的CAR-T细胞监测方案，对开展CAR-T细胞治疗的研究机构，该监测方案有很好的参考意义。研究者同时指出，光谱流式细胞术为多色流式的开展与应用提供了极大的优势，即使是常规的临床治疗检测（如本文展示的CAR-T治疗监测），也能从光谱流式获益匪浅。

 

参考文献： 1. S. Capiau, M. Buysse, V. Janda, et al. SPECTRAL (R)EVOLUTION IN FLOW CYTOMETRY: EVALUATION OF THE CYTEK® AURORA. 2. Mueller, Karen Thudium, et al. "Cellular kinetics of CTL019 in relapsed/refractory B-cell acute lymphoblastic leukemia and chronic lymphocytic leukemia." Blood, The Journal of the American Society of Hematology 130.21 (2017): 2317-2325. 3. Poorebrahim, M., Melief, J., Pico de Coaña, Y. et al. Counteracting CAR T cell dysfunction. Oncogene 40, 421–435 (2021). https://doi.org/10.1038/s41388-020-01501-x

 

 

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