FRET信号实时解析-全光谱流式拓展病毒感染动态研究

 

γ疱疹病毒（γHV）

γ疱疹病毒（γHV）是一种高度保守的DNA肿瘤病毒家族，可在宿主中建立终身潜伏感染，并随时间推移侵染多种类型的细胞。对于大多数感染者，γHV得到很好地控制；但在一些免疫抑制个体中，病毒的慢性感染被证实与恶性肿瘤的发展有关。美国科罗拉多大学安舒茨医学分校研究人员使用Cytek^®️ Aurora全光谱流式细胞仪，建立了基于FRET报告分子的病毒-宿主动态追踪方法，并在鼠γ疱疹病毒（MHV68）感染腹腔体系中开展研究。研究发现MHV68急性感染以腹腔巨噬细胞为主要靶点，且能够引起腹腔免疫图谱的剧烈变化。单细胞水平的病毒-宿主动态研究为急性γ疱疹病毒感染提供了全新见解。

 

图1. 疱疹病毒透射电镜图

 

以往的研究中，常使用有限稀释法追踪各组织中的MHV68感染，虽染可灵敏检测病毒的存在，但无法定位感染目标细胞类群。本研究通过β内酰胺酶（βlac）标记的鼠γ疱疹病毒（MHV68.LANA:βlac）作为报告病毒，病毒感染宿主后表达βlac，水解FRET荧光底物CCF2-AM，引起染料光谱特征改变。Cytek Aurora强大的光谱解析性能能够在多色表型分析的同时清晰分辨裂解/未裂解FRET底物荧光信号，从而追踪特定细胞类群的病毒感染动态变化。（图1）

 

 

图2. Blac水解CCF2-AM引起光谱特征改变，光谱解析后可定位病毒感染细胞

 

与CCF2-AM搭配使用的表型分析方案（12色）圈门策略如图3所示，该方案可清晰区分T/B细胞、DC细胞、单核细胞、中性粒细胞、大/小腹膜巨噬细胞（LPM/SPM）等类群并包含MHV68感染相关靶点。

 

图3. 腹膜细胞表型分析方案圈门策略

 

通过对病毒感染后1-14天的样本进行检测，研究人员发现MHV68引起腹膜细胞组成与表型发生显著变化，分别包括：CD8T、SPM、单核细胞细胞丰度的增加，LPM的短暂消失以及LPM中MHCII、SPM中CD86的表达上调（图4）。其中LPM的消失被称为“巨噬细胞消失反应”，与炎症刺激相关，在这一反应中，LPM可能会携带抗原进入大网膜，刺激B细胞在乳斑中的成熟。

 

 

 

图4. 病毒感染后引起腹膜细胞组成与表型发生显著变化

 

接下来，研究人员通过βlac裂解CCF2-AM信号分析了MHV68.LANA:βlac感染细胞的分布情况，实验结果表明，病毒可在腹腔中对多种靶细胞（巨噬细胞、B细胞、DC细胞）进行侵染。其中巨噬细胞感染比例最高：病毒对LPM的侵染在第3天出现峰值；第8天的数据中，SPM/单核细胞为主要感染源。B、DC细胞的感染虽然比例较低，但抗原提呈细胞的感染可能为局部抗原特异免疫反应和病毒在组织间的迁移提供了可能。

 

 

图5. MHV68.LANA:βlac在各细胞类群中侵染状态追踪  

总结

该研究工作结合FRET实时解析及多色免疫表型分析提供了一种全新的病毒侵染宿主表征手段，实现了MHV68与宿主间相互作用的动态追踪。作者在文中特别提到，βlac裂解CCF2-AM体系高强度的荧光信号与宽带的发射光谱对多种荧光染料的共用产生干扰，Cytek全光谱流式强大的光谱解析性能对该研究顺利开展起到重要作用。

 

参考文献：

Riggs JB, Medina EM, Berg LJ, et al. Optimized Detection of Acute MHV68 Infection With a Reporter System Identifies Large Peritoneal Macrophages as a Dominant Target of Primary Infection. Front Microbiol. 2021. doi: 10.3389/fmicb.2021.656979.

 

 

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