多重自发荧光提取，Cytek带你深度解析炎症组织中的髓系细胞

自发荧光 ( Autofluorescence, AF）提取功能是光谱流式区分于传统流式的重要功能特征，得益于信号采集与光谱解析算法的全面升级，Cytek全光谱流式细胞仪能够将样本自发荧光信号作为独立荧光组分进行扣除。在肿瘤、酵母等自发荧光成分相对简单的样本中，仅需将未染色样本设为自发荧光便可轻扣除，但对于巨噬细胞等复杂样本，在一群细胞中准确识别多种光谱特征相近的自发荧光组分依然较为困难。为此，Cytek研发团队联合庞培法布拉大学研究人员利用4激光Cytek^®️ Aurora开发了异质性自发荧光分离与鉴定方法，为极具挑战的炎症组织样本高维髓系细胞流式检测提供了全新思路，并基于此方法建立了针对再生骨骼肌组织中高自发荧光髓系细胞的16色检测方案，相关研究成果于2022年发表于Cytometry Part A。

图1. 准确解析独立自发荧光组分是髓系细胞高清分辨的关键

 

巨噬细胞中的AF主要来自于细胞内的胶原蛋白、NADPH，以及CD163吸收环境中铁分子后所生成的血红素，其发射光谱几乎覆盖流式检测的全部通道。组织内巨噬细胞的自发荧光特征可根据其激活状态和功能的差异表现出极大的异质性。如在小鼠骨骼肌损伤模型中，研究人员区分了5群具有差异光谱特征的独立自发荧光群体（图1），并通过5色方案（为最小化实验中荧光染料间泄露的影响）验证了多重AF提取（图2，Strategy 3），相比于不提取AF（Strategy 1）以及提取平均化AF（Strategy 2），可显著提升分群质量。图2. 同时提取多个自发荧光组分获得最佳信号分辨

 

未染色样本多重AF的提取是通过对Raw Data中特征通道所生成的散点图进行精细圈门而实现的。如图3所示，通过Step 1中的逻辑圈门，可从样本中逐级提取多个独立AF组分。为避免这一过程中引入的多组分光谱的污染，需进一步评估每组AF中的光谱形态，并通过散点图中的分群情况进一步识别潜在的特异性AF光谱（Step 2）。如此可实现样本AF特征光谱的过采样（在此样本中共采集12个AF光谱），以确保不会遗漏独立的AF光谱特征。图3. 过采样确保特征AF光谱充分采集

 

随后，研究人员将过采样的AF光谱导入到新的实验中，并通过相似指数（Similarity^TMIndex，SI）矩阵识别光谱特征相同的AF组分。由于Cytek全光谱流式可分辨SI≤0.98的相似染料，在这一环节中，认为SI>0.98的AF光谱为相同AF组分。最终，5个独立的巨噬细胞AF组被有效区分（图1,4）。
图4. 利用Similarity^TM Index矩阵合并相同AF组分

 

在确认了巨噬细胞的多个独立AF组分并成功实践5色方案后，研究人员进一步将染色方案拓展至16色，圈门策略如图5所示。为针对性研究再生骨骼肌组织浸润的髓系细胞，方案是用CD3、NK1.1、CD19作为谱系标记排除T、B、NK细胞。在髓系细胞群体中（CD11b+），通过Ly6G、Siglec-F的表达分别圈门嗜中性粒细胞及嗜酸性粒细胞。由于组织中DC、单核、巨噬细胞共表达多种标志物，需结合恰当的圈门策略进行区分：该方案首先通过MertK、CD64的表达确认巨噬细胞，并通过CD11c、MCHII区分DC细胞；最后在非巨噬、DC及两种粒细胞群体中，通过CD64、F4/80的表达圈门单核细胞。随后，巨噬细胞群体可根据CD163、CD169、Ly6C、CD115及CX3CR1的表达进一步细分。图5. 小鼠再生骨骼肌组织16色髓系细胞方案

 

该方法学研究表明，对于炎症组织中的髓系细胞分析，基于Cytek全光谱流式的多重自发荧光提取技术可以显著提升弱表达标志物的信号分辨，并带来更准确的细胞丰度检测结果，完美解决传统流式在高自发荧光样本检测中的信号误读问题。相比于同样能够屏蔽自发荧光干扰的质谱流式技术，光谱流式在实现多色分析的同时保留细胞活性，兼容高纯度分选，对于下游单细胞测序技术的样本前处理具有重要价值。

Cytek于2021年推出世界首台石英杯激发全光谱流式分选平台Aurora CS，搭载Cytek专利FSP^TM全光谱检测技术，拥有着无限可能性和优越的数据表现，引领着流式分选进入新时代。

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参考文献

Kharraz Y, Lukesova V, Serrano A L, et al. Full spectrum cytometry improves the resolution of highly autofluorescent biological samples: Identification of myeloid cells in regenerating skeletal muscles[J]. Cytometry Part A.

 

 

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Cytek^® Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器—Aurora和Northern Lights™分析系统、Aurora CS分选系统、试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。

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