硬核流式操作指南—多色方案设计与配色原则

在多色方案搭建中，深入了解实验相关生物学背景、仪器配置、标志物表达水平、染料理化性质（如亮度、光谱特征、稳定性），并依据科学的配色原则合理搭配生物标志物与荧光抗体，对于获取高质量的分析结果至关重要。本期硬核操作指南将结合多篇经典研究工作，就高维流式分析中的重要技能—多色方案设计流程与配色—展开介绍，硬核流式操作指南，给你有据可查的流式操作技巧。

 

 

>> 明确实验中的科学问题与生物学背景

 

方案搭建前，需明确实验所要解决的科学问题，以便合理设计实验。这些科学问题大致包括：需收集哪些数据验证实验假设；何种类型的数据（如平均荧光强度、细胞丰度及细胞计数等）能够更合理地反映实验现象；哪些组织样本需要被分析；其中的限制因素（如组织消化、稳定性及自发荧光等）有哪些；需如何处理样本以获得感兴趣的数据（如固定、破膜、刺激等）？

实验所涉及科学问题明确后，应尽可能详细地了解实验体系的生物学背景，以备后续配色环节参考。这些生物学背景包括定义细胞类型、分析细胞功能所需的生物标志物，以及这些标志物的表达量与共表达情况。我们推荐以细胞分型信息表（图1）及抗原信息表（图2）为模板对实验所需生物学信息进行整理。

 

1

细胞分型信息表：

对实验需检测目标细胞类群、定义细胞类群所需的谱系标记以及尽可能丰富的标志物共表达情况进行整理。

 

图1. 细胞分型信息表示例。

2

抗原信息表：

列出抗原名称、类型（用于谱系标记或信号读出）、克隆号（根据发表文献或前期实验经验确定）、经验抗原表达量（可通过流式抗体试剂网站查询）以及荧光抗体可用染料种类。

 

图2. 抗原信息表示例。

 

>> 确认仪器可检测荧光染料与染料理化信息

 

Cytek^®全光谱流式细胞仪可以对能够被机载激光器激发，且最大发射波长在365-829 nm内的染料进行检测，并区分光谱特征存在差异的染料。Cytek^®官网提供了方便易用的光谱查看器（图3），从中可以快速查看Cytek^®全光谱流式仪器配置及可用染料光谱特征。

 

图3. Cytek^®光谱查看器工作界。

 

光谱查看器中，Cytek^®提供了染料相似指数（Similarity^TM Index，0-1之间的数值）计算工具，当相似指数接近0时表示两种染料光谱特征差异很大，接近1时表示光谱特征非常接近。选定多色方案所需染料后，点击“Similarity^TM & Complexity^TM”可调取相似指数信息，通常经验性地认为Cytek^®全光谱流式细胞仪可区分相似指数小于0.98的两种荧光染料（如FITC/BB515; FITC/GFP）。此外将方案中所有染料交叠所得相似指数加和后可获得方案复杂指数（Complexity^TM Index），用于全面衡量多色方案的可行性。图4为Cytek^® TBMNK试剂盒8色方案相似指数及复杂指数计算结果，方案中cFluor^® V450与cFluor^® V420两种染料光谱特征最为接近，相似指数为0.87，整体方案复杂指数为4.02，预示着良好的分群效果。

 

图4. Cytek^® TBMNK试剂盒（8色）方案相似指数

及方案复杂指数信息。

 

除了解光谱特征与染料间相互影响外，染料亮度对于多色配色具有重要参考价值。受染料摩尔吸光系数、荧光量子产率、激光功率、激发效率等因素影响，不同染料在流式检测中表现出不同的亮度，领域内常通过染色指数（Staining Index，SI）判定染料在仪器中的亮度表现。图5中列出了三激光Cytek^® Aurora（B-V-R）全光谱流式细胞仪对53种流式常用染料对人CD4染色SI检测结果，可用于配色参考。值得注意的是，对于搭载561 nm（YG）激光器的机型，PE系染料因在YG激光下具有更高的激发效率而表现出更大的SI。因此在多色配色时，应参考同型号仪器测定的SI数据。

 

图5. 53种常见染料在3激光Cytek^® Aurora平台的

人类CD4染色SI排序。

 

Tips：

染色指数(Staining Index，SI)是一种测量荧光色素相对亮度的方法，并以生物学相关的方式将其与其他荧光色素进行比较，计算方法为SI=（MdnFI_pos-MdnFI_neg）/(2×SD_neg)。SI常用于多色配色中衡量荧光染料亮度，也是评价抗体滴定的实用工具。

 

>> 多色配色原则

 

在多色方案设计流程中，最复杂的环节是将合适的荧光染料与每个感兴趣的标志物进行匹配。荧光染料的亮度、荧光抗体的可用性、标志物的表达和共表达水平以及荧光干扰等问题都需加以考虑。按照标准化流程进行配色可以帮助大家更全面地利用已有信息，提升方案可行性。在此，我们将参考Cytek^® 40色经典方案（Cytometry Part A，OMIP-69）配色流程进行介绍。

 

 

1）对荧光抗体可用染料种类有限的标志物进行配色

 

为尽可能减少定制化试剂的使用，需对商品化荧光抗体可选择染料种类更少的标志物进行优先配色，以降低实验成本。

 

2） 为一级抗原（抗原分级见下方Tips）和共表达水平较高的抗原分配染料：

 

将亮度较低的染料分配给一级抗原或共表达水平较高的抗原，从而最小化染料间光谱干扰所带来的影响。

 

3） 为三级抗原分配染料：

 

为最大化检测分辨率，将亮度较高且受其它染料荧光干扰较小的染料分配给三级抗原。同时也可参考文献中成熟的方案或实验室往期经验进行荧光染料及抗体克隆号选择。

 

4） 为剩余的标志物分配荧光染料：

 

对于剩余的标志物（主要为二级抗原），染料分配时需要重点考虑荧光干扰对于分辨率的影响。尤其是对于细胞共表达标志物，需注意尽量选用荧光干扰较小的染料。

 

5） 选择细胞活性染料：

 

由于细胞活性染料的可选范围较大，通常建议在配色的最后阶段进行确定。

Tips：

Mario Roederer团队提出了抗原分级的标准，常用于在多色配色中描述标志物表达情况。其中一级抗原为已被广泛研究并用于细胞主群区分的高表达抗原，通常染色后有明确的阴阳性分群（eg. CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20等）；二类抗原为已被广泛研究，表达量相对高但具有连续表达情况的抗原（eg. CD27、CD28、CD45RA/RO、IFN-γ、Perforin等）；三类抗原为低表达抗原（eg. CD25、趋化因子受体等）以及未被广泛研究，表达量不明确的标志物。

分配染料时，推荐以下表辅助配色。该表格以三激光Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪为例列出了激光器种类及对应荧光通道，可在最大激发光及最大发射波长对应的空格中记录配色所需染料，并按配色流程标注染料对应标志物及细胞种类。一般来说，同种激光激发的荧光染料发射峰越接近，产生的荧光干扰及扩散误差越大；染料被不同激光激发时，也会对其他激发光所对应的通道产生干扰。因此可通过此表格的行与列粗略地评估共表达标志物分配染料后的荧光干扰，应避免共表达标志物出现在表格的同一行中或同一列的相邻位置。更准确的荧光干扰信息可通过相似指数或CSI矩阵进行确认。

 

表3. 多色配色工作表

（适用于3激光Cytek^® Aurora/Northern Lights^TM机型）

 

配色完成后，应对多色方案中的荧光抗体、细胞类型进行逐一核对，以确保方案可行性。需重点考察：荧光干扰较大的染料组合是否被分配于非共表达标志物；用于抗原表达强度定量分析的标志物是否被分配于受干扰小的荧光染料；染料亮度与标志物表达情况是否符合强弱搭配原则。

 

 

结 语

 

本期硬核操作指南与大家共同梳理了高维流式方案设计流程与配色原则，作为一种科学的实验设计思路，以上流程/原则适用于传统及光谱流式的新方案搭建以及成熟方案的评估与优化。需值得注意的是，精心设计的配色方案为高质量多色分析数据提供了良好的开端，但在后续分析中，仍需按照合理的流程对样本制备与上机流程进行优化。更多流式操作技巧，欢迎阅读往期硬核流式操作指南。

 

 

 

 

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参考文献

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2.Park L M, Lannigan J, Jaimes M C. OMIP‐069: Forty‐color full spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of major cell subsets in human peripheral blood[J]. Cytometry Part A, 2020, 97(10): 1044-1051.

3.Mahnke Y D, Roederer M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay[J]. Clinics in laboratory medicine, 2007, 27(3): 469-485.