硬核流式操作指南：抗体滴定知多少，解密影响抗体滴定结果的因素

抗体滴定是流式多色分析中的必备流程，通过抗体滴定工作曲线，我们可以获得最佳的抗体用量，在提升数据质量的同时节约实验成本。往期推文中，我们探讨了抗体滴定的操作流程及注意事项，为加深对这一关键流程的理解，我们将继续从算法，电压条件，数据类型，自发荧光等六个方面为大家解密抗体滴定结果的影响因素，帮助大家更合理地设定染色条件。

 

图1. 抗体滴定结果的影响因素

 

抗体滴定原理回顾

 

抗体滴定的本质是在抗体的特异性与非特异性结合中寻找最佳的平衡。过低浓度的抗体无法饱和或有效结合抗原位点，导致染色不均或信号较弱；而过高浓度的抗体引起低亲和非特异性结合效率的提升，此时阴性、阳性群体信号均增加，但分群效果下降。利用抗体滴定工作曲线，选用不引起背景明显提升且信噪比最佳的染色条件，将给您带来更好的信号分辨。

 

图2. 抗体滴定原理

 

抗体滴定影响因素

1. 算法

在抗体滴定样本采集完之后，我们往往用染色指数（SI，SI=（MFI pos-MFI neg）/(2×SDneg)）的计算方法来绘制抗体滴定工作曲线，选择不引起背景明显提升且信噪比最佳的抗体染色浓度。但比较染料强度的算法不止一种，还可以直接通过Signal-to-Noise Ratio，Separation Index进行计算（图3）。对比结果显示，不同的算法并不影响抗体滴定结果中最佳染色浓度的选择。

 

图3. 通过不同算法计算不同的抗体的染色情况

2. 电压条件

我们使用Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪中内置优化好的电压条件CytekAssaySetting的设置，以及在所有通道电压降低50%和升高50%的条件下，进行抗体滴定样本的采集，从结果可以看出，电压的改变并不影响抗体滴定结果中最佳染色浓度的选择，但是低的电压条件会使得抗体本身的分辨率降低，所以在做抗体滴定的时候，我们还是要选择合适的电压条件。

 

图4. 比较不同电压条件下，所采集的抗体滴定样本计算的染色指数

3. 数据类型

全光谱流式细胞仪在采集完数据之后，我们可以获得未解析的原始数据（raw data）以及解析后的数据（unmixed data）两种类型，那么在计算抗体滴定结果的染色指数的时候，我们到底要用哪种数据类型来做呢？相信大家也有很多困惑，在这里，我们给大家进行了实验验证，数据表明，无论你用raw data还是用unmixed data去进行计算，都并不影响抗体滴定结果中最佳染色浓度的选择。

 

图5. 比较通过不同数据类型所计算的抗体染色指数

4. 自发荧光

自发荧光是细胞自然有的荧光水平。细胞自身荧光可能是由于胶原蛋白和弹性蛋白、环状化合物如NADPH和核黄素、芳香氨基酸和细胞器如线粒体和溶酶体的存在。细胞内的水平会因这些产生荧光的细胞化合物和细胞器水平的差异而变化。一般来说，较大的细胞和颗粒较多的细胞由于荧光化合物数量的增加而增加了自身荧光。全光谱流式细胞仪的一大优势在于，可以通过识别自发荧光光谱，从而将自发荧光的干扰从样本中去除。那么在做抗体滴定的时候，我们是否也需要对数据做自发荧光的处理之后，再进行染色指数的计算呢？针对这个疑问，我们给大家进行了验证，数据表明，是否扣除自发荧光并不影响染色指数的计算结果，但是去除自发荧光，可以在一定程度上提高抗体的染色分辨率。

 

图6. 比较自发荧光扣除前后对于抗体染色指数的影响情况

5. 样本类型以及制备方式

流式实验中涉及的样本类型繁多，样本制备方式也可谓多种多样，那么不同的样本类型以及不同的样本制备方式（例如表面染色和固定破膜染色）是否会影响抗体滴定的结果呢？我们首先利用大家在实验中常用到的两种样本类型，全血以及提取的PBMC进行抗体滴定实验，结果表明，不同的样本类型对于抗体滴定合适浓度的选择是有差异的。

 

图7. 比较不同样本类型对于抗体滴定结果的影响

 

另外，我们还用表染的样本以及固定破膜之后的样本进行抗体滴定实验，结果表明，不同的样本制备方式同样会影响抗体滴定合适浓度的选择。

 

图8. 比较不同样本制备方式对于抗体滴定结果的影响

6. 不同仪器

目前流式市场百家齐放，大家所拥有的仪器可能来自不同的厂家，或者来自同一厂家的不同型号，那么我们是否需要在每一台仪器上做一遍抗体滴定的实验呢？针对这个疑惑，我们为大家比较了不同仪器之间的抗体滴定结果，结果表明，即使染色指数在不同的仪器上计算出来的结果有差异，但是根据染色指数绘制的滴定工作曲线所选择的最佳抗体浓度是没有差别的。

 

图9. 比较不同厂家的仪器对于抗体滴定结果的影响

 

总结

 

详尽的数据表明，在抗体滴定实验中，合适抗体滴度的选择与算法、仪器电压的设置、数据类型、是否去除自发荧光、流式细胞仪器的型号无关。但是利用Cytek Assay Setting 的电压设置和去除自发荧光可以进一步提高抗体染色的分辨率。合适抗体浓度的选择会受到样本类型以及染色方式的影响，所以要对每个marker按照多色样本的染色步骤进行滴定操作，确定它合适的抗体滴定浓度。

 

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参考资料：

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