Big Panel Theory 系列之--3激光31色精细免疫分型方案

近年来，精细免疫细胞分型在各类疾病中的应用逐渐普遍，从表征致病机制到帮助制定有效治疗方案，其作用正在变得日益重要。然而，一方面，由于可用于相关检测的样本往往比较有限，另一方面，随着人们对免疫细胞亚型及其相互关系的了解不断深入，越来越多的免疫标记被希望放到一个方案中同时检测。因此，多参数免疫方案便成为精细免疫分型必不可少的需求，而具有超强多参数检测优势的全谱流式细胞术便成为了精细免疫细胞监测的强大工具。

 

基于商业化染料，5激光配置的全光谱仪器可在单个样品中表征40个或更多参数；而已有研究报道了3激光配置的全光谱仪器可以检测多达34色的方案，当然，该34色方案中包含了尚未商业化的荧光染料。^1,2,3

 

近期，来自德国柏林的研究团队近期发表了他们基于3激光Cytek^®Aurora全光谱流式细胞仪的31色精细免疫分型方案。研究团队表示，经过精心的方案设计，他们的31色方案，全部使用的是已经商业化的市售荧光染料，无需任何定制试剂，并且，该方案还可根据不同的研究重点进行调整，更换或纳入其他感兴趣的检测标记。⁴

 

 

 

研究方法

将来自于健康志愿者的抗凝（EDTA）全血样本制备成单细胞悬液，在配备有3个激光器和38个检测通道的Cytek^®Aurora全光谱流式细胞仪的上进行分析，检测方案即为研究团队精心设计的31色精细免疫分型方案。方案能够识别人类外周血中所有主要的免疫细胞类型（表1），包括T、B、NK、单核等细胞亚群，以及较低频的细胞亚群如嗜碱性粒细胞和树突状细胞等，同时还包含一些功能标记，如趋化因子或模式识别受体和淋巴细胞激活/记忆标记等，详细的标记及对应荧光素、抗体滴度、主要作用等信息请参考表1。

 

 

表1-3激光31色方案的试剂组成

 

 

设门策略

髓系设门策略

如图1 所示，在排除双细胞、死细胞和内皮细胞（CD31+ CD45−）后，通过CD3 - CD19−和CD56 - TCRVα7.2−依次设门，从CD45+白细胞中排除淋巴细胞。通过CD66b+ CD16+识别中性粒细胞，CD66b+ CD16−CD15+ CD33+识别嗜酸性粒细胞。余下的CD66b-群体包括不同亚型的单核细胞、嗜碱性细胞和树突状细胞。经典单核细胞为CD14+ CD16−，非经典单核细胞为CD14−CD16+，中间单核细胞为CD14+ CD16+；经典单核细胞和中间型单核细胞也表达CD163。进一步分析经典和非经典单核细胞CCR2、CX3CR1、TLR2和CD11b的表达情况。在CD14 - CD16 -群体中，用HLA-DR - CD123+识别嗜碱性粒细胞，用 HLA-DR+ CD123+ CD303+识别浆细胞样树突状细胞，常规树突状细胞则为HLA-DR+ CD11c+ CD1c+。（图1）

 

 

图1- 31色方案髓系设门策略
 

淋系设门策略

如图2所示，在排除SSC-low细胞、双细胞、死细胞和内皮细胞，并鉴定出CD45+活细胞后，通过CD163 - CD66b -设门排除剩余的髓系细胞。随后，用CD19+， CD56+ CD3−，CD56+ CD3+，以及CD56−CD3+分别鉴定B、NK、NKT以及T细胞。将NK细胞进一步细分为CD56bright NK细胞（CD56high CD16low）和CD56dim NK细胞（CD56 low CD16high）。在T细胞中，分别鉴定出MAIT细胞（CD161+ TCRVa7.2+），其他非常规T细胞（CD161+ TCRVa7.2−）和常规T细胞（CD161−）。后者进一步分为CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和调节性T细胞（Treg, CD4+ CD25+ CD127−）。然后根据CD4+和CD8+ T细胞中CD45RA、CD45RO、CXCR3和CD27的表达，区分不同的功能亚群，如naïve和记忆T细胞。（图2）

 

 

图2- 31色方案淋系设门策略

 

 

研究结论

经过以上实验证实，在一个标准的3激光（红、蓝和紫激光）配置的全光谱流式细胞仪上，一管31色方案是完全可行的，并具有很好的数据表现。最重要的是，方案中使用的所有荧光染料和偶联抗体都是已经商业化的，简化了后续可能的方案调整与修改，便于不同研究者根据各自的研究需要删减/替换/增加感兴趣的检测标记物。值得注意的是，此31色方案是基于3激光的全光谱流式细胞仪器，在全部使用商业化染料的情况下，报道的首/个突破30色的单管方案，并用实际数据证实了Cytek全光谱流式的超强多参数检测能力。最后，研究者还指出，该31色方案目前仅利用了38个检测通道中的29个，相信随着越来越多的新型荧光染料被开发，未来基于三激光系统的多色方案将有很大的可能扩展到31色以上。

 

参考文献

Park, L. M., Lannigan, J., & Jaimes, M. C. (2020). OMIP-069: Forty-color full spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of major cell subsets in human peripheral blood. Cytometry. Part A, 97(10), 1044– 1051.

Sahir, F., Mateo, J. M., Steinhoff, M., & Siveen, K. S. (2020). Development of a 43 color panel for the characterization of conventional and unconventional T-cell subsets, B cells, NK cells, monocytes, dendritic cells, and innate lymphoid cells using spectral flow cytometry. Cytometry A, 1– 7.

Seong, Y., Nguyen, D. X., Wu, Y., Thakur, A., Harding, F., & Nguyen, T. A. (2022). Novel PE and APC tandems: Additional near-infrared fluorochromes for use in spectral flow cytometry. Cytometry. Part A, 101(10), 835– 845.

Hammerich, Linda, et al. "Resolving 31 colors on a standard 3‐laser full spectrum flow cytometer for immune monitoring of human blood samples." Cytometry Part B: Clinical Cytometry (2023).

 

 

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