钙离子信号在免疫反应中扮演着重要的角色，钙离子的浓度变化调控着细胞代谢、增殖、分化、抗体和细胞因子分泌、细胞毒作用等过程。T细胞膜表面和细胞器分布着各种钙离子通道，当T细胞受到活化时T细胞受体（TCR）介导钙离子内流。Indo-1在流式实验中经常被用作钙离子指示染料，在紫外激光照射下，Indo-1和钙离子结合与否可以呈现出两种荧光发射光谱。由于Indo-1荧光发射光谱范围宽，容易对其他荧光造成干扰，在传统流式上使用较为受限，甚至需要预先纯化T细胞亚群，以减少方案中其他荧光抗体的使用。全光谱流式打破传统带通检测限制，广泛兼容流式染料，能够轻松分辨相似荧光染料，在Indo-1指示剂使用同时，还能在方案中设计多个荧光抗体细化免疫细胞分群。

 

全光谱流式钙流实验流程

 

1. 在6 x 10^6 cells/mL小鼠脾脏或其他组织细胞悬液中加入滴定好的Indo-1（浓度一般在3-5μM，以说明书推荐为准）和Fc受体阻断剂，在37℃/5% CO2恒温箱中孵育45min

    

2. 洗去未结合的Fc受体阻断剂，重悬细胞，并放回37℃/5% CO2恒温箱中静息30min

    

3. 细胞静息结束后，离心并用4℃培养基洗细胞

    

4. 用500 μL 4℃培养基重悬细胞，加入抗体mix，冰上孵育30min

    

5. 洗去未结合的抗体，用4℃无酚红的培养基重悬后冰上保存

    

6. 使用Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪获取数据。流式上机检测时，每管都提前用37℃珠浴7min，保持37℃恒温检测

    

7. 样本预先获取30s数据，取下样本管，加入CD3抗体（推荐克隆号17A2），继续上机检测7min。再取下样本管，加入离子霉素，继续获取数据30s

    

8. 单染对照组设置：1) 加入离子霉素刺激的Indo-1结合钙离子组；2）加入EGTA螯合剂的Indo-1无钙离子组；3）细胞活性染料组live-dead Ghost540（稀释比1:7500）；4）分别7个抗体组 αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCPCy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7, CD1d/α-galcer tetramer-APC；

   阴性对照组设置：不加荧光染料的细胞

 

 

钙流实验流程示意图

全光谱流式钙流数据赏析

全光谱流式可以一键解锁荧光光谱全貌，光谱图显示Indo-1结合钙离子（离子霉素刺激钙离子转运到胞内）时荧光光谱最高峰在UV1，而没有结合上钙离子（EGTA螯合胞外的钙离子）则最高峰在UV7，光谱拟合后可以清晰地对比出两种状态下Indo-1的形状差异（黄色箭头所示）。

 

 

Indo-1结合钙离子与否对应光谱的差异

 

全光谱流式钙流实验的门控策略展示，首先通过时间轴检测液流稳定性，前面有小段数据空白是由于停止获取数据，加入CD3抗体再重新获取，目前软件版本更新后可以点击暂停再继续获取，数据连续性呈现更好。圈选淋巴细胞群，排除细胞碎片、红细胞、黏连体和死细胞后，从CD19-细胞中细分出CD4+和CD8+亚群，进一步绘制了CD4+细胞的钙流图示，截取其中一段时间呈现了结合与未结合钙离子的Indo-1对应的不同状态。

 

 

全光谱流式钙流实验设门逻辑

 

同样的分析策略应用到小鼠胸腺样本。以Indo-1结合钙离子的荧光信号与时间轴作图，截取4个时间段分别观察Indo-1趋势变化，从而反映胞内钙离子的水平，包括TCR刺激前钙离子处于基线水平，CD3抗体刺激后的峰值，峰值出现5min后胞内钙离子水平逐渐下降恢复到基线，加入离子霉素后钙离子又瞬时回升。圈选CD4+，CD8+，CD4+CD8+，iNKT (CD1d/α-galcer+)， CD25+，TCRγδ+T， CD19+等不同细胞亚群，依次观察胞内钙反应随时间的改变。

 

 

小鼠胸腺不同细胞亚群的钙流监测

结语

本期硬核流式操作指南分享了如何使用全光谱流式玩转钙流实验。由于Indo-1荧光发射光谱宽，相较于传统流式带通检测带来钙流实验多色方案的受限性，全光谱流式能够实现异质性样本纵向精细分群的同时，还能对每一类细胞亚群的钙反应给出横向平行对比的结果。文章基于小鼠原代T细胞设计了10色钙流方案，适用于小鼠不同组织的检测，也可在此骨架方案基础上进一步拓展设计更多色的方案。关于样本制备和更多上机实验细节，欢迎大家阅读参考文献原文和观看文章作者讲座视频。

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参考文献

Perrenoud, L., Conley, J. & Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. Journal of visualized experiments : JoVE, doi:10.3791/64526 (2022).