Cytek®明星天团携手，揭示天然免疫细胞PMNs免疫应答

下述来自美国弗吉尼亚大学医学院的研究，利用了Cytek明星产品Cytek^® Aurora™全光谱分析系统，Cytek^® Aurora™ CS分选系统和Cytek^® Amnis^® ImageStream^®X Mk II成像流式细胞仪，将光谱与成像技术结合，深度揭示了PMN在天然免疫应答中的作用。

研究者首先在5激光的Cytek^® Aurora™全光谱分析系统上开发了22色全光谱的方案，详细分析原代人PMNs在活化、脱颗粒、吞噬、迁移、趋化等过程中的表面标志物表达情况。此外，结合Cytek^® Amnis^® ImageStream^®X Mk II成像流式细胞仪强大的成像和统计能力，可直观呈现每个PMN的细菌吞噬量。进一步还结合了Cytek^® Aurora™ CS分选系统分选出吞噬不同细菌量的PMNs，以便对不同细胞群进行深入表型分析（图1）。

图1：研究流程简图

如图2所示，研究者设计一个22色全光谱流式方案对健康人外周血中的PMNs进行分析，该方案能够以高维方式分析人PMNs，同时关注PMNs的功能和活化状态，并且在分析过程中不破坏样本，以便进行下游分选/分析，适用于该领域的多种研究问题。

图2：检测PMNs的全光谱流式方案中的抗体组合

按照配色原则为每个抗体匹配合适的荧光染料，在后续方案中利用CellTrace Blue（BUV395通道）对淋病奈瑟菌进行标记，整体方案如图3A所示。并且在此方案中未使用FITC或AF488等这些使用频率极高的染料，便于后续的研究者扩展方案。利用Cytek^®全光谱查看器（Full Spectrum Viewer）直观评估方案复杂度，图3B展示了整个22色方案的复杂度指数为9.25，而在加入AF488染料后，整个方案的复杂度未变化，展示了方案的可拓展性。

图3：在5激光Cytek^® Aurora™全光谱系统上

检测PMNs的方案以及方案的复杂度的评估

在总细胞中排除死细胞和粘连体，排除CD14阳性细胞后，圈选出活的PMNs细胞（图4），以分析PMNs在抗原和病原菌刺激活化后其吞噬、脱颗粒作用、粘附或迁移以及趋化受体相关的表型。

图4：单个活PMN细胞的圈门策略

佛波酯（PMA）是一种强效蛋白激酶C激动剂，可激活中性粒细胞。使用PMA处理PMNs后，利用Cytek^® Aurora™全光谱分析系统检测发现PMA可显著改变多个表面标志物的表达。在三个不同受试者中，9种标志物表达一致上升（其中CCM、CD64、CD63、CD11b-active和fPR1具有统计学显著性，而CD32、CD18、CD47及BLT1未显著），6种标志物的表达一致下降（CD16、CD62L、CD44和C5aR1具有统计学显著性，CD35与CD172未显著），图5中利用UMAP降维分析直观展示了第三个受试者数据。全光谱流式多维分析能界定激活PMNs中的特定细胞群，为后续深入研究提供必要线索。

图5：UMAP展示PMA激活的PMNs的表型

为验证22色全光谱检测方案在探究PMNs与病原体相互作用中的应用价值，研究者将CellTrace Blue标记的淋球菌和PMNs以1:1或10:1的感染复数（MOI）共培养。在Cytek^® Aurora™全光谱分析系统的结果表明：8种标志物在淋球菌刺激后呈现表达量上升（CCM、CD64、CD63、CD66b、fPR1、CD18、CD11b-active及BLT1），且呈现与MOI正相关的趋势，5种标志物在感染后表达一致性下降（CD16、CD172、CD62L、C5aR1和CD44）。

此外，CellTrace Blue荧光信号评估PMNs的细菌负载量发现：MOI=1时细胞阳性率为8.2%-62.7%，而MOI=10时阳性率超过97%（图6A）。MOI=10组的MFI较MOI=1组高10倍以上，且荧光强度分布也更均匀（图6B）。

图6：A）各实验条件下PMNs的阳性率及CellTrace Blue平均荧光强度；

B）贴壁细胞组、MOI 1组与MOI 10组中CellTrace Blue荧光强度的代表性分布图。标记线标示CellTrace Blue阳性信号的设门界限。

进一步探究MOI=1处理时细胞阳性率的异质性，使用Cytek^® Amnis^®成像流式系统进一步分析荧光强度与细菌负载量的相关性：可根据CellTrace MFI将处理后的细胞分为无淋球菌、低细菌负载和高细菌负载群体（图7A），发现高细菌负载群体MFI是低细菌负载的19.2倍（图7B）。成像流式分析结果还显示CellTrace强度与PMNs结合细菌数量正相关，使用Cytek^® Amnis^®系统强大的点计数功能，可以对PMNs细胞内吞噬的细菌进行直观的成像和计数，发现高负载群体通常携带10个以上的细菌（图7C）。

图7：使用Cytek^® Amnis^®成像流式系统

分析每个PMN中细菌的负载情况

进一步，使用Cytek^® Aurora™ CS全光谱分选系统分选出MOI=1条件处理后的无淋球菌、低细菌负载和高细菌负载的PMNs群体，随后在Cytek^® Aurora™全光谱分析系统上对这三群细胞进行进一步的分析。结果如图9C所示，CCM、CD64、CD63、CD11b-active和fPR1的表达量随细菌负载量增加而升高。即使是未吞噬淋球菌的细胞，其CCM、CD64和CD63表达也高于未感染对照组。

图9：细菌暴露水平与负载量的对PMNs表面标志物的表达模式影响

本研究中，研究者开发和验证了适用于人的PMNs的22色高维光谱流式细胞术检测的方案，结合5激光Cytek^® Aurora™全光谱分析系统检测PMNs的活化状态，经研究证实该22色光谱方案具有广泛的适配性，并且还可根据不同研究者的实验目的进行方案的扩充。此外，利用Cytek^® Amnis^®成像流式细胞仪和Cytek^® Aurora™ CS全光谱分选系统，可针对性的分析PMNs吞噬细菌后的不同群体的异质性，进一步拓展PMNs检测的应用深度和广度。