资深专家Maria C. Jaimes专访：全光谱流式vs传统流式--核心差异、技术优势与应用场景

Jaimes：全光谱流式细胞术与传统流式细胞术的核心差异，在于信号采集光学系统的不同。

流式细胞仪所配备的激光器激发荧光染料，随即释放光子，信号采集光学系统确保这些光子被光电检测器“捕获”，进而将光信号转换为电信号。

传统流式细胞仪的设计原理，是依靠长通滤光片与带通滤光片的组合，仅捕获特定波长的发射光信号。这些滤光片旨在捕获与特定荧光染料发射峰对应的波长。举个例子，如果传统流式细胞仪需检测FITC与PE荧光染料，则该仪器将分别配备中心波长530 nm与575 nm的滤光片。这些滤光片还限制了每个检测器捕获的、未分配给该检测器的光子数量。

传统流式细胞仪的光学系统设计局限性

全光谱流式细胞仪的设计旨在尽可能多地收集发射光子。其光学系统不仅捕获荧光染料被激发后的峰值发射光，还能捕获整个发射波长范围（即全光谱）。由于荧光染料具有宽激发谱，因此可以被仪器上的多个激光器激发。例如，PE可以同时被紫激光（405 nm）、蓝激光（488 nm）和黄绿激光（561 nm）激发。在全光谱流式细胞仪中，由所有激光器激发产生的发射光子均被与各激光器耦合的检测器阵列捕获，并用于构建完整的发射光谱特征。这就是全光谱流式细胞仪比传统流式细胞仪拥有更多检测器的原因。

另一个关键区别在于将每个检测器（传统流式）或多个检测器（全光谱流式）捕获的光子正确分配给特定荧光染料的数学计算方法。在传统流式细胞术中，这种算法称为补偿；而在全光谱流式细胞术中，则称为解析。

点击下方视频，探索全光谱流式技术奥秘。

Jaimes：光谱解析是一种数学处理过程，用于识别标记了多种荧光染料的颗粒的整体信号中，每种荧光染料的贡献。在全光谱流式细胞仪中，光学检测器所捕获的信息称为原始数据。在一台配备64个荧光检测器的全光谱流式细胞仪中，原始数据就是由这64个检测器各自捕获的信号。解析数据则来自标记目标颗粒的每种荧光染料所产生的信号。因此，解析过程旨在将原始数据转换为由每种荧光染料产生的信号。

目前存在多种算法可用于光谱解析，但“普通最小二乘法”（OLS）最为常用。为使算法解析准确，用户需制备恰当的单染对照（等同于补偿对照），以构建方案中使用的每种荧光染料的完整光谱。这些对照必须与多色样品中染料的光谱完全匹配，并遵循传统流式细胞术中生成最优补偿对照的相同规则。

Jaimes：全光谱流式细胞术具备一系列优势，核心优势如下：

荧光染料选择的灵活性：传统流式细胞仪仅能基于与各激光器匹配的光学滤光片检测特定的荧光染料。相比之下，全光谱流式细胞仪能够检测仪器机载激光器所激发的任何荧光染料，从而为用户在实验中选择荧光染料提供了更多选择。

多色性能：全光谱流式细胞仪凭借其光学系统设计及发射光的数学解析方法，实现了大量荧光染料的同时使用。例如，Cytek基于5激光的全光谱流式细胞仪，发表了一个包含45种独特荧光染料的抗体组合方案（OMIP-109）。

兼容相似染料实现多色方案的更高分辨率：全光谱流式细胞术支持使用更多荧光染料，更重要的是，当使用高性能仪器并配合正确的方案设计与优化时，所获数据的质量也更为优异。OMIP-069与OMIP-109文章可佐证该结论，其凭借复杂方案下产出的高质量数据，已成为流式细胞术领域的经典参考方案。

自发荧光提取：全光谱流式细胞术可以表征自发荧光，并将其从多色样品的混色信号中“提取”出来，从而在使用高自发荧光样品时提高数据分辨率和检测准确性。

Cytek^®全光谱分析（FSP^®）技术具备显著性优势

Jaimes：全光谱流式细胞仪可实现传统流式细胞仪的所有应用，同时还能开展一系列依靠全光谱技术方可完成的专属应用，具体包括：

高参数精细免疫分型方案：根据已发表的数据，3激光配置的全光谱流式可实现24色方案检测，5激光配置则可支持50色方案检测。当检测样本的细胞量有限时，这类高参数方案的优势尤为显著，例如肿瘤活检样本、儿科样本、小鼠脑组织样本等。

高自发荧光细胞/样本相关应用：可将高自发荧光信号从荧光染料的特异性信号中提取出来，以此提升检测分辨率。以红细胞裂解后的全血免洗检测方案为例，该方法可实现不同细胞群的精准绝对计数，但在传统流式细胞仪中，这类检测会产生大量背景噪音，检测分辨率极低。而全光谱流式细胞仪可解决这一技术局限--通过对背景噪音进行识别表征，并将其从方案所用荧光染料的真实信号中“提取”出来，即可消除噪音干扰。

无标记检测应用：仅凭自发荧光光谱表征，即可实现不同细胞或颗粒的识别。例如在海洋生物学领域，研究人员可依据不同藻类的自发荧光特征，完成对藻类物种的精准鉴定。

Cytek^®全光谱分析（FSP^®）技术拓展全方位应用