Amnis™系统的图像+定量分析妙招，轻松突破Nanovial单细胞EVs分泌量的检测瓶颈！

Nanovials捕获单细胞及其分泌的EVs

绝大多数细胞分泌的EVs表达CD9，CD63和CD81，为了避免捕获抗体和检测抗体竞争同一个结合位点，本研究中在Nanovials上标记CD63的抗体，以结合细胞分泌的EVs，并使用CD9的抗体来检测Nanovials上捕获的EVs。将人永生化间充质干细胞（iMSC）与Nanovials以1:1的浓度比例共孵育，尽可能得到仅结合单细胞的Nanovials。

Amnis™成像流式检测Nanovials中

单细胞EVs分泌情况

为了表征装载单细胞的Nanovials的EVs分泌情况，并确定EVs特异性标记是否能与相关细胞的染色区分开来，研究者首次使用Amnis™成像流式细胞仪进行分析。该技术利用高分辨率的成像技术，结合mask等软件分析工具，可以完美地解决将Nanovials的染色和细胞的染色区分开的难题。

将iMSCs装载到标记了CD63的Nanovials上，收集细胞分泌的EVs累积达24小时以后，使用CD9的抗体标记Nanovials。由于细胞表面存在一些CD9抗体的染色，为了区分EVs的信号和细胞表面的信号，研究者在数据分析的时候，使用Amnis™系统分析软件中的mask功能（定义感兴趣的区域），创建了一个Secretion mask（Nanovials的图像区域减去细胞的图像区域，图2）。Calcein AM是活细胞的染料，用于标记活细胞，其染色区域可用来表征细胞的mask。使用CD9染色的mask减去Calcein AM染色的mask，即可得到Secretion mask。

图2：利用Amnis™系统的mask技术，创建Secretion mask

在Secretion mask中，查看CD9-BV650的表达，从直方图中，圈选CD9表达更高的群体，从图像可直观看出，CD9的信号主要在存在于Nanovials的腔体中。而对于CD9表达极低的这些细胞，其CD9的信号仅存在于细胞中。直观展示了利用Secretion mask圈定感兴趣区域的准确性和有效性。（图3）

图3：分析Secretion mask中CD9表达量高和极低的群体

进一步研究者想要了解细胞分泌EVs量的情况，可针对secretion mask所在区域进行分析。以CD9的表达强度为横坐标，以CD9信号的总面积为纵坐标绘制流式图。发现CD9信号的总面积和CD9的表达强度的比值越高，提示Nanovials中细胞的EVs分泌量较高。从图像中可以明显看出红色框中的群体EVs的分泌量更高，蓝色框的群体EVs的分泌量较低（图4）。流式图上EVs分泌量的分布也进一步揭示了细胞分泌EVs量的异质性。

图4：创建CD9强度VS. CD9总面积的流式图，

分析细胞分泌EVs量的异质性