体内CAR T疗法顶刊！双载体系统体内编辑T细胞，开创新一代细胞治疗策略

顾名思义，这是一类在患者体内直接“制造”CAR T细胞的前沿免疫治疗方法，其克服了传统CAR T疗法体外制备周期长、产品质量不稳定、成本高昂等关键挑战，通过直接向患者体内递送携带CAR基因的病毒载体（以慢病毒为代表）或非病毒载体（以脂质纳米颗粒为代表），在体内原位将自身T细胞改造成CAR T细胞，以获得靶向杀伤肿瘤细胞的能力。

图1 – 体内（in vivo）CAR T疗法示意图¹

体内CAR T的现有技术要么依赖瞬时表达，作用持久性不足；要么依靠DNA载物随机整合，缺乏靶向特异性。全球体内CAR T与精准基因编辑领域的著名科学家Justin Eyquem携手诺贝尔奖得主、CRISPR-Cas9 基因编辑技术的共同发明者Jennifer A. Doudna，在期刊《Nature》上发表了一项里程碑式的研究²，通过双载体系统（包膜递送载体EDV+腺相关病毒AAV）体内精准基因编辑，将CAR基因整合到T细胞特异性基因座TRAC，成功地在血液恶性肿瘤、实体瘤的人源化小鼠模型体内生成达到治疗水平的CAR T细胞，被誉为新一代体内CAR T疗法。

图2 – 双载体系统实现体内CAR T技术的重大突破

研究人员采用不同处理条件下的人源化小鼠分离的脾细胞，基于5激光Cytek^® Aurora™全光谱流式细胞仪设计了24色方案，通过设置组别特异的未染对照，使用特色的自发荧光（AF）提取功能进行数据解析，显著性提升了数据分辨率。Cytek^® Aurora™全光谱流式细胞仪提供了适用不同场景的自发荧光提取功能，针对同质性样品可直接勾选提取AF；针对异质性样品使用AF Explorer智能化识别多重AF；针对混合性样品采取组别特异的未染管对照特异性提取AF，灵活适配多元应用场景。

图3 – Cytek^®全光谱流式细胞仪24色方案

研究人员设计了四组EDV/AAV双载体组合，递送至人源化小鼠体内后发现，抗CD3 EDV/AAV-hT7组合的载体转导CAR的效率最高，实现了彻底的B细胞清除（图4a-d）。基于Cytek^® Aurora™全光谱流式细胞仪，研究人员选取转导CAR基因的小鼠中CAR阳性（EGFRt⁺）与CAR阴性（EGFRt^-）T细胞，对比了T细胞表型及功能差异，未处理的小鼠设置为对照组。结果显示，未处理小鼠与CAR阴性T细胞没有显著性差异（图4e-k），说明载体输入对T细胞表型的影响不大。CAR阳性T细胞的CD4⁺及CD8⁺亚群增殖能力更强（图4f），TOX阳性群体增多，其中27.4%仍维持TCF1表达（图4g-j）,表明生成了一群高增殖活性的CAR T细胞，既能响应肿瘤抗原（TOX阳性提示被激活），又保留了自我更新和长期存续的潜力（TCF1阳性提示干性与记忆性）。同时，调节性T细胞表达下调（图4k）。综上所述，证明体内成功生成了TRAC-CAR T细胞，这也是首次在原代T细胞中实现大片段目的DNA的体内定点整合。

图4 – 优化体内TRAC-CAR T细胞生成

这项研究是CAR T细胞领域的里程碑之作，借助EDV/AAV双载体系统，实现了体内高效构建TRAC-CAR T细胞，证实了在血液系统恶性肿瘤及实体瘤模型中的疗效，具备极高的临床转化潜力，是前景优异的新型治疗平台。

本研究基于5激光Cytek^® Aurora™全光谱流式细胞仪设计了24色T细胞表型及功能性方案。值得一提的是，Cytek近期发布的Cytek^® cFluor™ 21色人源T细胞试剂盒（R7-40012）也提供了T细胞精细化分型的“拿来即用”方案，欢迎点击下方图片获取详情。

图7 - Cytek^® cFluor™ 21色人源T细胞试剂盒全新发布