3激光23色：寄生虫感染小鼠肠道免疫高维分析

多色分析作为流式细胞术最重要的使用需求，持续推动该领域发展。受到流体聚焦稳定区域有限、荧光染料易光漂白等因素的影响，一味地增加激光数量无法充分提升仪器多色检测性能。全光谱流式通过先进的光学系统及光谱解析算法，全方位突破传统流式多色极限，使研究人员可以用更少的激光完成复杂多色分析。以下将对Cytek Aurora 3激光23色肠道免疫研究工作进行介绍。

为高清监测寄生蠕虫感染下肠道免疫细胞类群与功能变化，深入探索蠕虫感染无法自愈的原因，J.U. Mayer等人利用多形螺旋线虫感染小鼠模型，结合三激光Cytek Aurora分析平台，建立了从组织消化到多色流式分析的肠道免疫深度表征方案（图1）。

图1. 多形螺旋线虫感染小鼠肠道免疫分析流程

蠕虫感染后，小鼠肠道产生强烈的II型免疫反应，分泌大量粘液，并伴随组织重塑和免疫细胞浸润，难以使用常规组织消化流程处理样本。该工作中，研究人员详细优化了组织消化方案，发现溶组织梭菌胶原酶A可有效消化严重感染的肠道组织（优化方案如图2）。经验证，优化后的组织消化方案可从每个小鼠十二指肠样本中提取数以百万的免疫细胞，活率高达70%-80%。

图2. 小鼠十二指肠单细胞悬液制备方案的优化
 

小鼠十二指肠样本3激光23色多色分析设门策略如图3所示，染色方案囊括了多种蠕虫感染II型免疫反应相关的表面与胞内标志物，可实现包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、固有淋巴细胞(ILC1/ILC2/ILC3)、效应T细胞(Th1/Th2/Th17)、Treg细胞、B细胞等40余种细胞亚群的高清分群。

图3. 寄生虫感染小鼠肠道免疫细胞23色光谱流式表征结果

研究人员对阴性及感染7/14/28天的小鼠十二指肠样本进行了全光谱流式检测，从而进一步评估小鼠在不同感染期（阴性/幼虫发育期/急性/慢性感染期）的肠道免疫状态，光谱流式数据通过FlowSOM聚类并结合手动圈门进行结果展示。（如图4）

图4. 不同感染阶段小鼠十二指肠样本光谱流式分析结果
 

各细胞亚群在不同感染周期中丰度与功能的变化表现出多种抗寄生虫免疫反应特征（图5）：如感染初期，嗜中性粒细胞、单核细胞等免疫细胞比例大幅提升，表明幼虫在肠道的发育引起强烈免疫反应；急性感染期，炎症反应逐渐消退提示蠕虫离开肠道组织并寄生于肉芽肿内；慢性感染期，所有细胞Ki67的表达下调，与蠕虫感染中的强免疫调节特征相符。

图5. 不同感染周期下目标细胞类群的丰度变化

该方法学研究建立了复杂肠道组织样本的高维流式表征方法，并首次报道了23色肠道免疫分析结果。除应用于寄生虫感染研究，此方案同样适用于食物过敏或炎症性肠病的免疫学研究。更多实验细节欢迎参考文章原文。