Big Panel Theory系列之 - 1管18色21标记人单核细胞研究方案

研究背景Study Background

单核细胞在炎症性疾病的传播和维持中的重要作用已被证实。因此，研究急性和慢性炎症性疾病中的单核细胞表型的动态变化可能成为预测疾病病程的一种工具。为此，研究者使用全谱流式细胞仪，开发了 一个1管18色21标记的人单核细胞表型研究方案。

   

研究方法Study Method

用Cyto-Chex试管（streck, La Vista, NE, USA）收集健康外周血，经密度分离获得PBMCs，然后按照表1中的免疫方案加入对应抗体进行染色。注意在加入其他抗体之前，需先依次加入CX3CR1, CXCR4, CD14, CCR2抗体。所有染色步骤均在37℃下进行。固定洗涤后，将处理好的样本在三激光配置的Cytek® Aurora全光谱流式细胞仪（Cytek Biosciences, Fremont, CA, USA）上进行获取和分析。

 

方案主要包括特异性系别标记如CD3, CD19, CD56, CD66b, CD123等，用以鉴定并排除T、B、NK、DC和粒细胞等细胞亚群；单核细胞亚群鉴定标记如CD14, CD16, SLAN等；以及功能性表面受体标记，如细胞因子受体CXCR4, CX3CR1，粘附分子受体CD11b, CD11c， 免疫检查点PD-1等。方案所使用标记及其作用等详细信息请参考表1。

 

表1-单核细胞表型研究方案详细信息

值得注意的是，研究者充分利用了不同系别标记特异性结合对应细胞的特点，将其中四个系别标记CD3, CD19, CD56, CD123均采用了FITC荧光素，以减少总荧光素的使用，降低方案的复杂度。

   

数据表现Data Presentation

用于排除非单核细胞和识别四个循环单核细胞亚群的设门策略如下图1和2所示。

如图1所示，对CD45+白细胞依次设门，依次排除CD66b + 和 CD3/CD123/ CD19/CD56 + 白细胞，并利用TLR2（泛单核标记），鉴定出单核细胞。

 

图1-设门策略-排除非单核细胞

然后，利用CD14, CD16, CCR2, SLAN四个标记，进一步鉴定单核细胞亚群。SLAN（6-Sulfo LacNAc）是近期报道的非经典单核细胞的代表标记。如图2 所示，利用这些标记，分别鉴定出四个单核细胞亚群：经典单核细胞（CD14++CD16-），中间型单核细胞（SLAN-CCR2 +），SLAN+非经典单核细胞（CD14-CD16++SLAN+）和 SLAN-非经典单核细胞（SLAN-CCR2-）。

 

图2-设门策略-鉴定单核细胞亚群

使用t-SNE将四个单核细胞亚群进行二维可视化分析，共32万CD45 +细胞用于t-SNE分析。红色门圈出TLR2阳性的单核细胞群。TLR2, CD14, CD16, CCR2和SLAN的热图显示了四个单核细胞亚群中每个标记的表达模式，红色表示高表达，蓝色表示低表达。（图3）

 

图3-利用t-SNE降维图进一步观察单核细胞

每个标记表达量最高的亚群（中位荧光强度）被指定为1，所有其他亚群则被指定一个与最高表达亚群成比例的值。从图4可见，方案中所检测的大多数标记在四个单核细胞亚群中表现出了不同的表达模式。

 

图4-方案中的大多数标记在四个单核细胞亚群中

有不同的表达模式

 

总结

研究者成功设计了一个18色21标记的全光谱流式细胞方案，用于外周血单核细胞的识别和表征。他们目前正在利用这个方案来探索急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction, AMI）患者的单核细胞表型，旨在确定具体哪个单核细胞表型与AMI后心肌愈合不良相关。对于探索单核细胞亚群与疾病相关性的研究，此方案无疑具有很好的参考与借鉴意义。

 

参考资料：

*Kathryn Hally, Laura Ferrer-Font, etc,. Comprehensive phenotypic analysis of monocyte subsets in human whole blood. CYTO,2021.