异体γδ T细胞可治愈神经母细胞瘤？深度剖析体外扩增细胞，优化新型T细胞治疗方案

研究背景

过继性细胞疗法 (Adoptive cellular therapies, ACT) 通常利用基因工程编辑 αβ T 淋巴细胞来表达合成嵌合抗原受体 (Chimeric Antigen Receptor, CAR)， 以增强T细胞的肿瘤识别和细胞毒性。CAR 修饰的 αβ T 细胞在许多恶性血液肿瘤的治疗中已显示出了很好的临床效果，但在实体瘤的应用中进展缓慢，这可能与缺乏实体瘤特异性抗原以及实体瘤免疫微环境 (Tumor Microenvironment, TME) 的免疫抑制有关。这也使得许多研究者开始探索更多新的治疗方法，其中γδ T淋巴细胞治疗就是一种新兴的细胞免疫疗法，对治疗肿瘤，特别是神经母细胞瘤，具有很好的临床前景。有研究显示，在所有肿瘤浸润性白细胞中，γδ T 细胞的存在与实体瘤的良好预后具有最显著相关关系。

γδ T 细胞表达多种细胞表面受体（如 γδ-TCR、NKG2D、DNAM-1等），对肿瘤细胞显示出固有的细胞毒性，这种细胞毒性不依赖于MHC识别，不需要共刺激信号，就能识别并杀死肿瘤细胞。研究显示γδ T 细胞具有抵消实体瘤TME 介导的免疫抑制，产生炎症细胞因子（如 TNF-α 和 IFN-γ等），将抗原呈递给内源性 αβ T 细胞，诱导树突状细胞成熟等能力。扩增的 γδ T 细胞亚群还表达 FcγRIII 受体 (CD16)，这是介导抗体依赖性细胞毒性 (Antibody Dependent Cellular Ctotoxicity, ADCC) 所必需的，可为单克隆抗体治疗提供协同效应。（图1）

 

图1- γδ T 细胞的抗肿瘤网络

 

γδ T细胞治疗的应用限制之一是不同供体间T细胞的体外扩增变异性，为了克服这一限制，来自美国亚特兰大埃默里大学医学院的研究人员开发了一种符合 GMP 的γδ T细胞体外扩增方案，并通过系实验对扩增后的γδ T细胞进行调查分析，包括研究供体变异性的来源，最终产品中γδ T细胞百分比对肿瘤细胞毒性的影响，以及扩增细胞对神经母细胞瘤的疗效（单药和与GD2单抗联合治疗）。此外，研究人员还对扩增后的细胞组分进行了深度表征，以确定最有效的细胞治疗的潜在生物标志物，前瞻性的指导未来的临床试验，帮助临床医生/研究人员选择最有潜力的健康供体进行 γδ T 细胞扩增。

 

研究方法

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研究人员使用唑来膦*酸盐和 IL-2 对来自16名健康供体的外周血单个核细胞 (PBMC) 的 γδ T 细胞的 Vγ9Vδ2 亚群进行无血清体外扩增（图2），并通过系列相关实验，证实以这种方式扩增的 γδ T 细胞在临床前模型中对多种肿瘤具有生物活性，包括小儿神经母细胞瘤。

图2-符合GMP的体外细胞扩增方案时间轴

 

对扩增后的细胞进行系列检测以验证细胞的体内体外功能，包括初步表型鉴定（CD3+ γδ-TCR+, CD3− CD56+NK），深度免疫表型分析（激活、抑制、衰老和耗竭标记），富集和耗竭研究，细胞毒性试验，激活试验，小鼠模型研究等。其中，光谱流式细胞术被研究者很好的应用在了在该研究的多个环节*，利用Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪（4和5激光配置），研究人员观察到了非常有价值的实验数据，为研究的关键结论贡献了不可替代的重要作用。（图3）

图3-利用光谱流式对扩增细胞进行深度免疫分型

 

*光谱流式应用的实验环节主要是：初步表型鉴定（CD3+ γδ-TCR+, CD3− CD56+NK），深度免疫表型分析（激活、抑制、衰老和耗竭标记），细胞毒性试验（体外），激活试验，小鼠模型研究（体内实验）。

研究结果

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研究人员观察到，来自不同健康供体的PBMC在唑来膦*酸和IL-2的刺激下，γδ T细胞和自然杀伤（NK）细胞均可获得高效扩增，但扩增产物中的γδ T细胞含量在不同供体间却有很大差异（12.2%-98.4%），终产物中γδ T细胞的含量与起始PBMC中NK细胞的比例呈负相关。而在缺少γδ T细胞的情况下，NK细胞的扩增效果很差。

深度免疫表型分析揭示，γδ T细胞和NK细胞均表现出与强细胞毒性相关的表型。如两者均表达高水平的能促进肿瘤识别的激活受体，包括CD314 (NKG2D) 和CD226 (DNAM-1)；和相较于激活受体，水平较低的的抑制性受体和耗竭标记，如CD159a (NKG2A)，CD279 (PD-1), CD366 (TIM3) 和 TIGIT等；以及一定水平的凋亡信号标记Fas（高）和FasL（低）。（图4）

 

图4-深度免疫表型分析γδ T细胞和NK细胞特征

 

体外实验显示，相较于γδ T细胞为主的扩增产物，以NK细胞为主的扩增产物表现出更强的抗肿瘤毒性，联合抗GD2单抗dinutuximab免疫治疗，两种细胞的抗肿瘤毒性效应均出现增强，尤其是γδ T细胞为主的治疗组，增强效果非常明显且具有显著统计学意义（图5右）。从图5可见，γδ T/NK细胞治疗联合dinutuximab免疫治疗，不仅可增强对抗肿瘤的毒性效应，并且这种对抗肿瘤的效应不依赖于细胞组成中γδ T/NK细胞的比例，这样便可最大限度的减少了由于不同供体间细胞扩增差异带来的影响。（图5左）

 

图5-联合使用dinutuximab单抗可促进γδ T/NK细胞体外抗神经母细胞的活

 

利用小鼠模型的体内实验进一步证实，通过静脉途径给药的联合治疗，扩增后的γδ T/NK细胞对异体神经母细胞瘤在体内的持续肿瘤消退作用与γδ T/NK比例无关。同时发现，相较于静脉给药，肿瘤内给药更能保证有足够数量的免疫细胞对抗肿瘤的毒性作用，肿瘤内γδ T细胞或NK细胞治疗联合dinutuximab (IV)和temozolomide (IP) 的系统治疗，相较于对照组，能够完全和持续的诱导小鼠肿瘤的退化。（图6）

 

图6-γδ T细胞治疗联合dinutuximab单抗免疫治疗的体内实验

 

研究结论

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小儿神经母细胞瘤是一种侵袭性颅外实体肿瘤，超过一半的高危患者因无法治愈而出现复发。将体外扩增的异体来源的γδ T细胞用于神经母细胞瘤的治疗，是一种具有临床前景的治疗方法。研究人员利用光谱流式对体外扩增的γδ T细胞进行了深度分析和验证，证实了扩增产物中的γδ T和NK细胞均具有对抗肿瘤的毒性效应，且NK细胞的存在与γδ T细胞的扩增潜力和γδ T细胞治疗的整体效果相关。进一步的体外和体内实验证实，抗 GD2 单克隆抗体 dinutuximab与体外扩增的 γδ T 细胞的共同给药可增强对神经母细胞瘤细胞的细胞毒性。联合temozolomide（替莫唑胺）与 dinutuximab （地努妥昔）和 γδ T 细胞治疗，可进一步增强抗神经母细胞瘤的细胞毒性，引起侵袭性神经母细胞瘤小鼠模型中的肿瘤细胞完全消退。

 

 

参考文献

1. Jonus HC, Burnham RE, Ho A, Pilgrim AA, Shim J, Doering CB, Spencer HT, Goldsmith KC. Dissecting the cellular components of ex vivo γδ T cell expansions to optimize selection of potent cell therapy donors for neuroblastoma immunotherapy trials. Oncoimmunology. 2022 Mar 26;11(1):2057012. doi: 10.1080/2162402X.2022.2057012. PMID: 35371623; PMCID: PMC8966991.

2. Gentles AJ, Newman AM, Liu CL, Bratman SV, Feng W, Kim D, Nair VS, Xu Y, Khuong A, Hoang CD, et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nat Med. 2015;21(8):938–945. doi:10.1038/nm.3909

3. Park, J.H., Lee, H.K. Function of γδ T cells in tumor immunology and their application to cancer therapy. Exp Mol Med 53, 318–327 (2021). https://doi.org/10.1038/s12276-021-00576-0

 

编者注：本文于4月28日在Cytek微信公众号进行了发表，但由于编者失误文中图4的图片错误，特更正后重新发表！

 

 

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