免疫原性细胞损伤多路分析方案：Cytek®全光谱技术加速小分子抗肿瘤药物发现

天然产物中众多结构新颖的活性分子在抗肿瘤药物研发中起到重要作用，如道诺霉素、鬼臼毒素等天然产物在诱导肿瘤细胞损伤的过程中招募并激活宿主免疫细胞，并产生适应性的抗肿瘤免疫反应，这一过程被称为免疫原性细胞死亡。然而，该领域的一个挑战是如何描述能够极大程度促进持久抗肿瘤免疫的细胞损伤和死亡形式。近期，美国范德比尔特大学药学系Bachmann等人利用Cytek^® 全光谱流式开发了一种兼容荧光编码的高通量免疫原性细胞损伤（ICI）分析方案，在一管检测中完成48个样本6种ICI信号的同时分析，相关研究成果发表于Journal of Biological Chemistry。

图1. 多种次级代谢产物诱导细胞损伤模型

 

ICI光谱流式分析方案搭建

化学诱导免疫原性的一个共同特征是损伤反应和细胞应激信号通路的激活（图1），包括细胞自噬调控、未折叠蛋白反应（UPR）、DNA应激和特定方式的细胞死亡。该研究所开发的光谱流式ICI分析方案包含了DNA损伤（γH2AX: PerCp-Cy5.5）、坏死（p-MLKL: Ax568）、凋亡（cCAS：PE）、有丝分裂(p-Histone H3: PE-Cy7)、自噬(LC3: Ax488)和UPR(p-EIF2α: Ax647)相关标志物，细胞损伤信号由阳性群体丰度进行数据展示（图2）。此外，方案使用NHS-Dye（可与细胞表面羧基共价结合）对样本进行荧光编码，以扩大检测通量。编码方案中，Ax750用于标记需解码的所有细胞，8个浓度梯度的Pacific Blue与6个浓度梯度的的Pacific Orange共形成48种编码形式。

 

图2. 高通量荧光编码细胞损伤检测方案实验流程与圈门策略

 

细胞ICI反应快速评估

方案搭建完成后，研究人员使用5种已知具备诱导ICI效应的天然产物（包括Bafilomycin A1、Etoposide、Nocodazole、Staurosporine和Thapsigargin）对三种白血病细胞系（K562，MV-4-11，Jurkat）进行刺激，并通过高通量光谱流式检测方案快速评估天然产物诱导有效ICI的最佳浓度与刺激时间。结果显示，每种白血病细胞系在不同刺激条件下都表现出独特的损伤情况，例如：Bafilomycin A1在nM水平测刺激下即可在3种细胞系中可诱导自噬标志物LC3表达；坏死标记物p-MLKL的表达对Nocodazole诱导更为敏感；UPR标志物p-EIF2α在K562细胞系中被Thapsigargin与Nocodazole激活，而在Juckat与MV-4-11细胞系中激活强度与剂量存在很大差异。

图3. 3种白血病细胞系在不同天然产物刺激下的ICI图谱

 

ICI活性天然产物的发现

为进一步拓展该ICI分析方案的应用场景，研究人员结合多种分离纯化与结构表征技术开发了未知ICI活性天然产物的发现流程。通过高效液相色谱（HPLC）分离多种放线菌代谢组提取物后，由光谱流式ICI检测方案定位活性天然产物，并通过质谱、核磁鉴定其组成。在这份工作中，研究人员发现链霉菌KPBlue17代谢产物中包含可引起细胞自噬、DNA损伤和凋亡标志物表达增强的活性分子，并确认了该活性分子为Narbomycin（图4）。

 

图4. HPLC第24号洗脱管中发现具有ICI活性的天然产物

 

总  结

得益于Cytek^®全光谱流式优异的多色分辨能力，该研究在传统细胞损伤方案（凋亡、DNA损伤和有丝分裂）的基础上引入了自噬、坏死和UPR检测指标，并结合荧光编码技术成功搭建了高通量ICI检测方案。该方案的开发对于新型抗肿瘤药物的发现、个性化治疗方案制定、细胞损伤机制评估等方面具有重要应用价值。

值得一提的是，在高通量药筛中，Cytek^®光谱流式技术灵活的荧光编码兼容性突破了上样速度带来的检测通量限制，如需了解更多荧光编码方案，请参考前期推文：流式也能Barcode，光谱流式技术一管20样本混样方案。

 

参考文献

Balsamo J A, Penton K E, Zhao Z, et al. An immunogenic cell injury module for the single-cell multiplexed activity metabolomics platform to identify promising anti-cancer natural products[J]. Journal of Biological Chemistry, 2022: 102300.

 

 

关于Cytek

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Cytek Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球技术 生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling™，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器 —— Aurora和Northern Lights™分析系统、Aurora CS分选系统、试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。

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注：Cytek^®, Tonbo Biosciences, cFluor^®, Full Spectrum Profiling™, FSP™和Northern Lights™是Cytek Biosciences, Inc. 的商标或注册商标。Cytek^®全光谱检测技术相关专利包括但不限于：US10739245B2，US11169076B2，US10788411B2。