CAR-T细胞产品的免疫表型影响临床疗效，EGFRvIII 特异性 CAR-T细胞的PD-1表达可预测复发性脑胶质瘤的治疗效果

研究背景

近年来，嵌合抗原受体 （Chimeric Antigen Receptor, CAR） T 细胞疗法已被证实在临床肿瘤的治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的新型精准靶向疗法。早期针对血液系统恶性肿瘤的研究表明，T 细胞和 CAR-T 产品的免疫表型和基因型特征可以预测治疗效果，但迄今为止，用以确定实体肿瘤临床反应的决定因素尚未明确。

 

图1-CAR-T细胞治疗胶质母细胞瘤示意图

 

来自美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院GBM卓越转化中心的研究团队，开发了用于治疗胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）的表皮生长因子受体变体 III （Epidermal Growth Factor Receptor variant III, EGFRvIII） 特异性CAR-T 细胞，并在早期的临床试验中取得了一定成效。但迄今尚无研究描述患者 T 细胞和CAR-T 细胞的内在特征和免疫表型，是否可用于预测 GBM 或任何其他实体瘤的治疗效果。因此，研究团队希望通过表征患者单采T 细胞和输注的CAR-T 细胞产品的特征，以确定可以用于预测EGFRvIII 特异性 CAR-T 细胞治疗复发性 GBM 的外周植入和临床反应的决定因素。

研究方法

研究团队利用全光谱流式细胞术，对来自EGFRvIII 特异性 CAR-T细胞治疗复发性胶质母细胞瘤临床试验（NCT02209376）的单采细胞和输注产品进行深度分析，以确定可预测临床反应的因素。研究中的临床反应是外周循环中的细胞植入和患者无进展生存期 （Progression-Free Survival, PFS） 进行量化。其中外周血的细胞植入，通过CAR-T细胞初始输注后，随访中在外周血中测量到的 log10 CAR 拷贝/μg 基因组 DNA 的 曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）进行量化。

全光谱流式细胞术基于Cytek^® Aurora流式平台完成，通过 一个28 个标志物的方案进行检测，检测标记包括细胞活力、CAR 检测、T 细胞标志物、激活标志物、免疫检查点抑制剂和其他免疫细胞亚群的标志物等。（图2）

 

图2-全光谱流式28标记方案详细信息

 

通过层级设门，对单采细胞及CAR-T输注产品的免疫特征进行鉴定和分析。在识别出淋巴细胞后，将 B 细胞 （CD19+）和 gamma delta T 细胞排除在外。接下来依次分离CAR+细胞和CAR-细胞，然后将每个细胞亚群分为CD3+和CD3-群体。之后，CD3+ 群体中的细胞进一步分层为自然杀伤 T 细胞 （CD3+CD56+）或 T 细胞 （CD3+CD56-）。再通过 CD4+ 和 CD8+ 染色进一步表征 CAR+ 和 CAR-CD3+CD56- T 细胞。CD3+ 淋巴细胞则根据 CD45RO 和 CCR7 阳性分为四个亚群：效应 T 细胞 （CD45RO-CCR7-）、Tem 细胞 （CD45RO+CCR7-）、幼稚样 T 细胞 （CD45RO-CCR7+）和 Tcm 细胞 （CD45RO+ CCR7+）。（图3）

 

图3-光谱流式分析设门策略

 

研究结果显示，CAR-T输注产品中的 CD4+CAR-T 细胞群的PD-1表达与外周移植物的总 AUC（r=0.7849，p=0.0122）和 PFS（r=0.8004，p=0.0096）均呈正相关。（图4）

 

图4- CD4+CAR+细胞的PD1表达与临床结果的相关性

 

在免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）分析中，发现输注产品中CD4+CAR+ 细胞的CTLA-4、TIM3 和 LAG3 表达与细胞植入或 PFS 没有显着相关性。然而，PD1+CTLA4+ （r=0.7338, p=0.0244）、PD1+TIM3+ （r=0.7430, p=0.0218）和 PD1+LAG3+（r=0.7331, p=0.0246） 的共阳性均表现出与外周细胞植入直接相关。此外，PD1+CTLA4+ （r=0.7739, p=0.0144）和 PD1+TIM3+（r=0.7107, p=0.0319）表达与更长的 PFS 相关。（图5）

 

图5-CD4+CAR+细胞ICIs（CTLA4, TIM3, LAG3）表达与临床结果的相关性

 

接下来对激活标志物与临床反应相关性的研究发现，GRZB和HLA-DR阳性与外周细胞植入或PFS无关。然而， CD4+输注产品中PD1+GZMB+和PD1+HLA-DR+ CAR-T细胞频率与外周细胞植入总AUC和PFS成正比。PD1+GRZB+共阳性与AUC （r=0.8217, p=0.0066）和PFS（r=0.7944, p=0.0105）相关；PD1+HLA-DR+也与PFS相关（r=0.7689, p=0.0155），而PD1+HLA-DR+与AUC的相关性不显著，但变化趋势与PD1+GRZB+相同。（图6）

 

图6-CD4+CAR+细胞激活标志物表达（GRZB, HLA-DR）与临床结果的相关性

 

在患者单采产品中，PD1 和免疫检查点抑制剂的表达与外周细胞植入或 PFS不存在任何显着相关性。

研究结果

结 论

结合上述研究结果，研究者认为，CAR-T 输注产品中的 PD1表达，无论是单独表达，还是与ICIs或激活标志物共同表达，都与外周细胞植入和 PFS成正相关，可以作为CAR-T细胞治疗复发性GBM疗效判断的重要指标。

讨 论

本文的研究结论与一些早期的研究显然背道而驰，在这些早期的研究中，记录了PD1作为T细胞衰竭的标志，并证明抑制/阻断PD1是一种改善T细胞增殖、激活和效应功能的有效手段。有研究证实阻断PD1可作为提高CAR-T治疗恶性肿瘤疗效的辅助手段，也有研究证实表达PD1的抗CD19 CAR-T细胞对慢性淋巴细胞白血病（CLL）的治疗反应较差。

为此，研究者指出，PD1不完全是T细胞疲惫的标志，也可能标志其他生理条件，如慢性抗原刺激或T细胞激活阶段。这便意味PD1的表达可能反映CAR-T细胞的激活状态，而不只是衰竭的状态，这也许能解释当前研究的发现。

研究者同时指出了本研究的局限性，比如样本量小，缺少确定临床终点的二元标记，仅适用于复发性GBM等，后续，研究者将基于本研究的结果，开展针对原发性 GBM 的 EGFRvIII 定向治疗的临床试验，进一步探索PD1 表达与抗 EGFRvIII 特异性CAR-T 疗效之间的机制或功能联系。

 

参考文献：

Tang, Oliver Y., et al. "PD1 Expression in EGFRvIII-Directed CAR T Cell Infusion Product for Glioblastoma Is Associated with Clinical Response." Frontiers in immunology 13 （2022）.

Li, Long, et al. "Chimeric antigen receptor T-cell therapy in glioblastoma: current and future." Frontiers in Immunology 11 （2020）: 594271.

 

 

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