Big Panel Theory系列之-1管21色小鼠DC细胞研究方案

Research Background

研究背景

树突状细胞（Dendritic cells, DCs）是抗原呈递细胞，在先天性和适应性免疫应答的调节中起着重要作用。DCs可促进抗肿瘤免疫反应，是有潜力的肿瘤免疫治疗靶标。DC细胞比例较低，且不同组织中的DC 亚群在起源、表型和功能存在差异。因此，精准的识别DC亚群及其功能性特征，对于开发新的肿瘤免疫治疗方案将非常有意义。

多色流式细胞术是研究DC亚群精细分群的重要工具，研究者利用Cytek^® Aurora 全光谱流式细胞仪，设计了一个一管21色免疫分型方案，用于对小鼠样本中的主要DC亚群进行深度免疫分型。本文将围绕方案的设计与优化进行重点介绍。

 

Research Method

研究方法

将来自荷瘤小鼠（MC38-FAP）和非荷瘤野生型小鼠（C57BL/6J）的肿瘤和脾脏制备成单细胞悬液，用于后续DC亚群免疫分型。DC分型方案一共包括了20个系别或功能相关标记（表1），主要用来识别和表征组织中主要的DC亚群，以及其他髓系或淋系细胞群。各标记对应的荧光素及主要作用请参考表1。

 

表1-21色DC亚群分型方案详细信息

 

利用上述标记，按照图1中所示的细胞亚群分群策略，可以将目标细胞亚群进行精确的识别和鉴定。

 

图1-各目标细胞亚群及对应免疫标记

 

将处理好的样本在Cytek^® Aurora 全光谱流式细胞仪（4激光）上进行获取和分析。按照图2显示的手动设门策略，分别识别出主要的DC亚群（cDC1, cDC2和pDC），以及淋巴细胞（T细胞/B细胞）和髓系亚群（巨噬细胞/单核细胞/MDSCs）等其他细胞群。

 

图2-手动设门策略

 

在整个方案开发过程中，研究者充分考虑并验证了可能影响实验结果的关键技术环节，如试剂选择、染色条件、参考对照的选择，光谱解析、自发荧光提取及数据分析等。在参考对照的选择上，研究者指出，当来自细胞（未染色）的自发荧光光谱与来自微球（未染色 ）的自发荧光光谱有显著不同时，基于细胞的参考对照将更有利于精准的解析。（图3）

 

图3-比较肿瘤细胞自发荧光光谱与补偿微球自发荧光光谱

 

研究者进一步详细对比了每个荧光标记基于微球和基于细胞的光谱图，并验证了各种参考对照组合（细胞和/或微球），对解析及最终实验结果的影响。（图4）

 

图4-BV421(A)和Zombie NIR(B)的参考对照比较

 

正确的解析，是获得真实准确的实验结果的前提。采用适当的细胞和微球参考对照组合，可获得更为准确的解析结果，实现更优的数据质量（图5）。关于如果选择参考对照，我们在硬核流式操作指南：荧光补偿，怎样调更可靠？一文中进行过详细描述，可点击文章链接进一步了解。

 

图5-基于微球（C）和基于细胞（D）参考对照的解析结果比较

 

同样的肿瘤样本，使用随机的基于微球的参考对照-未优化方案（图6A）或特定的参考对照组合-优化后方案（图6B）进行解析，可以看到，未优化方案无法鉴定cDC2细胞群。可见，研究方案的优化与否，将直接影响是实验结果的真实性和准确性。

 

图6-利用未优化（A）和优化（B）方案解析的结果对比

 

优化的方案，帮助研究者在肿瘤及脾脏组织中，成功鉴定出了目标细胞亚群（cDC1, cDC2,  pDC,  mDC等），并通过手动（图7A）及自动分析（图7B&C）进一步印证了结果的在准确性。

 

图7-手动（A）和自动分析肿瘤（B）及脾脏（C）的结果

 

Conclusion

总结

研究者设计了一个21色DC细胞研究方案，并通过一步一步仔细的验证和优化，实现精准的解析，获得了最为真实可靠的实验结果。本研究中的实验方案，对于那些探索DC细胞的疾病免疫反应，开发新型免疫疗法的研究，具有很好的参考意义。同时，研究者对方案谨慎仔细的优化过程，也值得进行多色实验的研究人员借鉴和学习。

参考资料

Heidi Poulet, Waleed Ali, Alienor Auge, etc., Optimizing 21 color flow cytometry panel for mouse dendritic cell immunophenotyping by full spectrum flow cytometer Cytek® Aurora. CYTO 2021.

 

 

关于Cytek

About Cytek /

Cytek^® Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球技术生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器—Aurora和Northern Lights™分析系统、Aurora CS分选系统、试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。

更多的相关信息，请登录Cytek的官方网站：www.cytekbio.com和www.cytekbio.com.cn。

注：Cytek^®, Tonbo Biosciences, cFluor^®, Full Spectrum Profiling™, FSP™和Northern Lights™是Cytek Biosciences, Inc. 的商标或注册商标。Cytek^®全光谱检测技术相关专利包括但不限于：US10739245B2，US11169076B2，US10788411B2。