Big Panel Theory系列之—22色小鼠固有淋巴细胞（ILC）高维分析方案

固有淋巴细胞（ILC）是一种主要分布于如肠道、肺、肝脏等实体组织（尤其在黏膜表面）的独特固有效应细胞群体，在宿主防御、组织重塑与修复、炎症调节以及维持代谢稳态中发挥重要作用。ILC可以根据局部炎症环境表现出极强的可塑性，往往需要更全面分析其表型及功能标志物，才能精准表征ILC各亚群在特定微环境中的异质性。为此，帝国理工大学Mincham等人利用5激光Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪搭建了22色小鼠ILC高维分析方案，并通过小鼠肺及小肠固有层（siLP）样本进行数据展示，相关研究结果发表于流式领域专业期刊Cytometry Part A （OMIP-86）。

 

图1. ILCs在肠粘膜的分布

 

方案设计及圈门策略

 

22色小鼠ILC高维分析方案标志物选择如图2所示，方案中包含了ILC祖细胞（ILCP）、ILC1、ILC2、NCR^+/-ILC3、CCR6⁺淋巴组织诱导细胞（LTi）样ILC3及成熟NK细胞亚群的谱系标志物，并纳入更多ILC、NK细胞相关细胞因子及增殖标志物，以表征其在外界刺激下的功能特征。

 

图2. 22色ILC高维分析方案标志物明细

 

数据分析方面，细胞经去黏连、排除红细胞（利用SSC-V与SSC-B散点图）、活性分析后，选取IL-7Rα+Lin-群体为总ILC细胞，并通过PLZF、IL-18Rα+识别ILCP细胞群体。小鼠肺与siLP中的成熟ILC分别由T-bet⁺ RORγt⁻ ST2⁻ CD49b⁻ IL-18Rα⁺ NKp46⁺ CD49a^+/− TRAIL^+/−  (ILC1)；GATA-3⁺ T-bet⁻ RORγt⁻ KLRG1^+/− ST2^+/− (ILC2)；RORγt⁺ T-bet^+/− NKp46⁺ CCR6⁻(NCR⁺ILC3)；RORγt⁺ T-bet^+/− NKp46⁻ CCR6⁻ (NCR⁻ILC3)以及RORγt⁺ T-bet^+/− NKp46⁻CCR6⁺ (CCR6⁺LTi-like ILC3) 圈门区分（图3.A-E）。组织驻留NK细胞（trNK）与循环NK细胞（cNK）分别根据CD49a和CD49b的表达定义（图3.H）。

 

图3. ILC高维分析方案圈门策略

 

小鼠肺部ILC增殖与细胞因子的表征，siLP对亚群特异性活化信号的应答评估，分别在PMA、离子霉素、Brefeldin A以及IL-12、IL-18 (pro-ILC1)、IL-33 (pro-ILC2)、IL-1β、IL-23 (pro-ILC3)的体外刺激后进行检测。体外刺激实验显示：siLP ILC2和ILC3亚群分别具有上调IL-13和IL-22的倾向，而肺ILC1在体外刺激后显著上调IFN-γ（图3.F,G）。

 

 

ILC细胞分析难点

 

在肺、小肠等组织样本的ILC研究中，样本自发荧光信号将在很大程度影响分群效果。即使在CD45+淋巴细胞群体散点图中仍然可以明确观察到自发荧光干扰（图4.B）。Cytek^® Aurora平台强大的自发荧光提取功能可以有效解决这一难题，为ILC的深度分析提供高质量检测结果。

 

图4. 自发荧光提取功能提升分群效果：

（A）未染色肺组织细胞，（B）染色CD45+淋巴细胞（对比数据来自OMIP-86 SI）

 

ILC的表征往往需要借助多种细胞因子受体、转录因子及细胞因子的检测，高分辨的信号检测将有助于这些弱表达/连续表达标志物的准确区分。通过抗体滴定实验寻找最佳的染色条件，可以有效降低抗体非特异结合的干扰提升信噪比。除此之外，Cytek^® Aurora平台更高的检测灵敏度也在仪器硬件层面为科研人员带来更好的信号分辨。

 

图5. 传统流式与全光谱流式抗体滴定对比实验（对比数据来自OMIP-86 SI）

   

总结

 

以上22色小鼠ILC全光谱流式分析方案全面描述了小鼠组织样本中ILC的表型和功能状态，并帮助研究人员获取到优异的分群效果。为保留方案的拓展性，研究人员在方案设计之初预留了多个可选染料通道（355 nm激发），以便读者在借鉴方案时可以加入更多感兴趣的标志物，从而进一步拓展方案。

     

 

参考文献

1.Mincham K T, Snelgrove R J. OMIP‐086: Full spectrum flow cytometry for high‐dimensional immunophenotyping of mouse innate lymphoid cells[J]. Cytometry Part A, 2022.

2.Klose C S N, Artis D. Innate lymphoid cells as regulators of immunity, inflammation and tissue homeostasis[J]. Nature immunology, 2016, 17(7): 765-774.