Nature子刊 | 25色全光谱流式方案绘制妊娠中期胎儿肠道免疫系统发育图谱

人体最大的免疫器官—肠道—中含有大量的免疫细胞，控制着人体对微生物群和食物抗原的局部反应，从而维持体内稳态。然而受到样本稀有等因素的限制，人们对胎儿阶段肠道免疫系统的时空发育知之甚少，相比于传统表征方法，新一代高维流式、成像等技术将为这类稀有样本的表征带来更全面的生物学信息。近期，荷兰莱顿大学医学中心Koning等人在Nature Communications期刊发表研究论文，结合全光谱流式细胞术、成像质谱流式（IMC）、单细胞测序等技术对14-22周孕龄的人类胎儿肠道样本展开纵向分析，全面揭示了妊娠中期肠道发育的免疫图谱。该工作中，Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪高维分析方案（共3组，分别为16-25色）贯穿研究始终，下文将对研究工作中全光谱流式精彩数据进行介绍。

 

图1. 胎儿肠道免疫系统表现出丰富的表型异质性，所有鉴定细胞亚群均包含Ki-67阳性群体

全光谱流式纵向分析胎儿肠道免疫图谱

 

为探究人类胎儿肠道免疫系统的组成与异质性，研究人员首先开发了Cytek^®全光谱流式25色分析方案（图5，Panel 1）用于胎儿肠道样本单细胞悬液分析，并通过optSNE降维展示。7种主要免疫细胞亚群由谱系标志物的表达鉴定，细分标志物的差异表达展现出胎儿肠道免疫细胞群体的丰富异质性（图1）。在所有鉴定的细胞亚群中，研究人员均观察到Ki-67+细胞群体，这一结果与免疫亚群定向分化细胞的持续增殖相符。

在对14-22周胎儿肠道样本的纵向分析中，研究人员发现固有免疫相比于适应性免疫细胞亚群更早出现：在第14周，ILC、B细胞和髓系细胞在胎儿肠道中已大量存在，从第15周开始，T细胞和B细胞在免疫系统中占主导地位。此外，Ki-67+细胞群体存在稳定存在于妊娠中期的所有免疫细胞类群。胎儿与儿童、成人肠道样本免疫图谱对比结果显示，除高丰度的Ki-67+细胞群体外，胎儿样本中CD4+T、ILC细胞丰度远高于儿童与成人，而CD8+T细胞丰度低于后者。

 

图2. 胎儿肠道样本全光谱流式纵向分析

胎儿肠道免疫细胞亚群增殖潜力的体外验证

 

随后，研究人员通过IMC发现大量的胎儿肠道免疫细胞表达CD127/IL-7Rα，并利用RNAscope观测到胎儿肠道的上皮和固有层中存在IL-7转录本，因而推测局部IL-7的产生与肠道免疫细胞的增殖相关。

为证实此推测，研究人员开展了胎儿肠道细胞的体外培养实验，以成人PBMC样本作为对照，分析IL-7的存在对肠道免疫细胞增殖的影响。不同细胞类群（包括ILCs、DN T细胞、CD8+ T、CD4+ T细胞及其亚群）的增殖情况由包含CellTrace™ Violet的16色全光谱流式细胞增殖分析方案进行评估（图5，Panel 2）。结果显示，在没有IL-7的情况下，方案所关注的细胞亚群均发生增殖，并伴有Ki-67的表达，IL-7的加入提高了增殖的强度。相比之下，PBMC样本未观测到显著的细胞增殖。对于T细胞群体，考虑到其对IL-7的敏感性，研究人员认为该群体为新近胸腺迁出细胞(RTE)，并推测在妊辰中期分化的免疫细胞到达肠道接受增殖信号而扩增，从而满足肠道在该时期的快速生长需求。

 

图3. 16色全光谱流式方案评估胎儿肠道细胞体外增殖能力

胎儿肠道免疫细胞功能特征分析

 

为了确定体外培养胎儿肠道免疫细胞的功能特征，研究人员在16色细胞增殖分析方案扩展至25色（图5，Panel 3），并重点查看了CD40L、颗粒酶B、TNF-α、IFNγ、IL-2和IL-17A的表达。培养48小时后，无论IL-7加入与否，均观察到高比例的ILC、DN T细胞和CD4+T细胞表达CD40L，而CD8+T细胞中CD40L阳性细胞比例较低；ILC、DN T细胞和CD8+T细胞中检测到颗粒酶B；所有细胞群的细胞内TNF-α、IFNγ、IL-2和IL-17A水平均较低。在IL-7存在的情况下，ILC、DN T细胞和CD4+T细胞中CD40L的表达量显著增加，且能检测到更高频率的CD40L+ 颗粒酶B+ ILC和T细胞。

 

图4. 胎儿肠道免疫细胞的功能分析

 

图5. Cytek^® Aurora全光谱流式高维分析方案抗体选择列表

 

总结

综上所述，该工作中研究人员使用多种多组学分析技术相结合，全面分析了妊娠中期胎儿肠道免疫系统的发育情况。三组Cytek^® Aurora全光谱流式高维分析方案在肠道免疫细胞群体异质性、体外增殖与功能分析中发挥重要作用。值得一提的是，文中25色细胞功能分析完全在16色细胞增殖方案基础上搭建，即便增改共11种标志物也无需重建方案，充分体现出Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪在染料选择、方案拓展的灵活性。更多实验详情，欢迎阅读文章原文。

 

参考文献

Guo N, Li N, Jia L, et al. Immune subset-committed proliferating cells populate the human foetal intestine throughout the second trimester of gestation[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 1318.