Big Panel Theory系列之—16色血小板全光谱流式高维分析方案

血小板是一种体积小但数量众多的无核血细胞，由于其结构简单（无细胞核）及明确的凝血功能，曾长期以来被认为是一种均质的细胞群体。随着研究的不断深入，人们逐渐意识到血小板表型和功能的多样性，以及它们在免疫、炎症过程中的重要作用。根据血小板的动态抗原谱，通常可以将其分为促凝血、促聚集、促炎症类型，它们在血液中不断受到促凝血激动剂、血管扩张剂和病原体等血源性物质的调控，从而引发更丰富的表型特征。

 

为了深度挖掘血小板的生物学信息、评估活化状态与体外反应性、发现更多未知表型，哈佛大学医学院Spurgeon等人使用Cytek^® Northern Lights^TM全光谱流式细胞仪开发了16色血小板高维分析方案，并归纳了血小板的常用标志物及样本制备流程，为血小板高维流式表征提供了全面的技术指南^1,2。

 

 

图1. 血小板由巨核细胞产生

血小板表面标志物

     

血小板的常见表面标志物可分为鉴定标志物、活化标志物、构成性标志物三类（图2），以下将对这三类标志物进行简要介绍。

 

鉴定标志物：

 

在正常个体中，血小板表面富含CD41、CD42a、CD42b及CD61，这些标志物常用于在流式检测中区分血小板与背景信号，因而归类为“鉴定标志物”。在特定的临床环境中，这些标志物的表达量可能发生变化，需谨慎选择。例如在激动剂刺激实验中，CD61通常在刺激后上调，更适合作为识别血小板的指标；相比之下，CD42a、CD42b的表达量可能降低。

 

活化标志物：

血小板可以将胞内分子表达于细胞表面，通过表型转换执行特定的功能。在有/无外源刺激的情况下，这些标志物的表达量可以用来指示血小板的反应性/活化状态。而这两种指标可能与多种疾病相关，常用于临床检测。多种血小板活化指标如图2所示，其中以CD62P和PAC-1的组合最为常用（用于区分促炎症/促聚集特征）。此外Annexin-V也常用于表征血小板促凝血特征；CD63、CD107a、CD154等标志物可能与血小板分泌组学相关。

 

构成性标志物：

除了可诱导的标志物之外，在流式检测方案中引入血小板表面大量存在的构成性标志物将进一步加强方案的类群分析与功能表征性能。一些构成性标志物的表达量可能在激动剂刺激后发生改变，从而影响血小板的功能。例如CD31和GPVI的水平随血小板在循环中老化而下降，CD29与整合素α链结合，介导粘附；高水平的HLA-ABC则表明其具有特殊的免疫功能。

 

图2. 血小板的常见表面标志物 

血小板的样本制备

血小板流式检测的样本制备流程如图3所示，即将外周血与抗体/试剂（受体激动剂/抑制剂）混合孵育，经裂红/固定处理后上机检测。该实验流程在染色环节保留了红细胞、白细胞、血浆等成分，以更充分地模拟生理/病理条件，并取消了离心清洗流程，以减少血小板的在样本处理中的激活风险²。样本制备中需注意1）在采样环节应选用柠檬酸钠抗凝以保持血小板功能，不建议使用EDTA或肝素；2）抗凝处理后的血样可以室温保存，应尽可能在采样后20-90分钟内完成样本制备；3）如需检测Annexin-V，需在缓冲剂中加入Ca2+以确保其与磷脂酰丝氨酸的结合；4）如检测PAC-1，需注意使用合理的浓度，防止血小板在染色中发生活化。

 

 

图3. 血小板全光谱流式检测实验流程
 

16色全光谱流式方案数据展示

Spurgeon等人利用Cytek^® Northern Lights^TM平台搭建的16色血小板高维分析方案标志物选择及数据结果如图4所示。样本经RP-XL/TRAP-6刺激后进行检测，由CD61区分血小板群体后利用FAUST算法进行自动分群。FAUST算法根据促凝血（Annexin-V）、促聚集（PAC-1）、促炎症（CD62P）标志物的表达将血小板群体区分为5个亚群，在UMAP降维展示中可清晰区分。其余标志物（如TLT-1、CD154等）在几个亚群中的差异表达预示着血小板功能亚群进一步细分的可能，充分体现该多色方案的新亚群发现能力。

 

 

图4. 16色血小板高维分析方案数据展示

 

总结

在过去的30年里，人们通常使用传统流式结合2-3个标志物区分静息和活化的血小板，但随着对血小板认知的不断深入，更多的标志物已被用于评估血小板在健康/疾病状态下的活化，药物刺激下反应性以及出血相关疾病的诊断等。本文所述的16色全光谱流式方案提供了一种强大的血小板高维分析手段，将为血小板的异质性与功能研究、新亚群发现提供全新视角。更多实验详情，欢迎参考文章原文。

 

 

参考文献：

1.Spurgeon B E J, Frelinger III A L. Comprehensive phenotyping of human platelets by single‐cell cytometry[J]. Cytometry Part A, 2022, 101(4): 290-297.

2.Spurgeon B E J, Frelinger III A L. Platelet Phenotyping by Full Spectrum Flow Cytometry[J]. Current Protocols, 2023, 3(2): e687.

 

 

关于Cytek

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Cytek Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling™，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器 —— Aurora和Northern Lights™分析系统、Aurora CS分选系统，Amnis®和Guava®品牌下的流式细胞仪和成像产品，以及试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。

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注：Cytek^®, Tonbo Biosciences, cFluor^®, Full Spectrum Profiling™, FSP™和Northern Lights™是Cytek Biosciences, Inc. 的商标或注册商标。Cytek^®全光谱检测技术相关专利包括但不限于：US10739245B2，US11169076B2，US10788411B2。

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