评估全光谱流式细胞术15色方案测定外周血白细胞亚群的准确性

在自动血液学分析仪上进行外周血白细胞（White Blood Cell, WBC）测定，已成为评估患者免疫状态的常规检查项目。近年来，全谱流式细胞术的快速兴起，推动了免疫细胞检测向更高参数发展，更多的检测参数使得白细胞亚群的分析更加全面，满足了临床研究日益增长的诊断和研究需求。

来自Cytek的研究团队设计了一个单管15色的人泛白细胞亚群检测方案（免洗）（Cytek^®cFluor^®Human Pan Leukocyte assay，LNW）（表1），可在全谱流式细胞仪上检测鉴定所有主要的白细胞亚群。包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、造血干细胞、单核细胞、T细胞、B细胞和NK细胞亚群等。

 

 

表1- Cytek^®15色人泛白细胞亚群检测方案的组成

 

为了验证此单管15色方案的准确性及样本兼容性，研究团队将此15色方案在不同来源样本中进行测试，并与传统方法进行平行对比，结果证实光谱流式15色方案不仅可用于不同收集方式来源的样本，且与传统方法具有一致的结果，是一种有效的、高灵敏度的流式细胞术方法，可用于临床和转化研究中监测外周血中的免疫细胞亚群。

 

 

研究方法

 

样本兼容性

将来自K2EDTA、肝素、ACD和Cyto-Chex^®采血管中收集的人外周血，用上述15色cFluor^®试剂，采用lyse-no-wash法染色，并在Cytek^®光谱流式细胞仪上进行分析，验证试剂的样本兼容性。

 

 

 

与传统方法的对比

使用12个健康供体样本，将15色光谱流式方案的检测性能，与传统白细胞计数（CBC），以及在BD FACSCanto™II上利用BD 6色TBNK 试剂所获得结果进行对比，验证数据的可比性。

 

 

 

测试精度   

将这些供体样品进行一式三份的重复检测，进一步检验15色试剂测定精度。

 

 

 

 

 

 

图1- Cytek^®15色人泛白细胞亚群检测方案染色流程

 

 

Cytek^®15色人泛白细胞方案的染色流程如图1所示。取100 ul全血样本，用制备的多色抗体预混液进行染色，孵育15分钟。然后用900 ul红细胞裂解/固定液裂解样品，即可在Cytek^®光谱流式细胞仪上进行检测。上样前不需要进行洗涤，这种lyse-no-wash的方式确保了在样品制备过程中最小的细胞损失。（图1）

我们在早期的文章中介绍过该15色泛方案的特点及设门策略，如需了解可点击下文链接阅读。

Cytek^®推出一管15色人泛白细胞鉴定试剂盒，提供全面完整的白细胞鉴别分析

 

 

研究结果

 

样本兼容性

结果显示，来自不同抗凝剂管采集的样本，最终获得的染色模式高度一致，除了在Cyto-Chex管来源的样本中观察到中间单核细胞百分比稍低，但这可以通过改进的Cyto-Chex管样本染色方案来纠正。证实该15色检测方法适用于使用不同抗凝剂管采集的全血样本。（图2）

 

 

图2-不同抗凝剂采集管来源的样本结果一致

 

 

与传统方法的对比

将光谱流式15色方案所获得的白细胞亚群百分比，与在全血细胞计数仪上获得的结果（CBC）进行比较，淋巴细胞亚群的百分比则与BD FACSCanto™II上的6C TBNK结果进行比较。结果显示，光谱流式15色方案与CBC或6C-TBNK亚群百分比的平均差异在+/ - 11%以内（样本数=12）。（图3）

 

 

图3-Cytek^®15色方案测定的WBC亚群百分比高度准确

注：Rel-百分比差异；Abs-绝对数值差异，当某细胞亚群为稀有群体时，采用绝对数值差异。

 

结合白细胞计数的双平台法，可获得的各细胞亚群的绝对计数。首先，使用血液分析仪获得白细胞和淋巴细胞计数。然后用CBC与15色方案结合的双平台法，计算获得个细胞亚群的绝对计数。对比结果显示双平台方法获得的绝对计数与CBC（表2）或BD 6C-TBNK（此处未展示）细胞计数可比。证实光谱流式15色方案与传统方法所获得的结果具有高度一致性。

 

 

表2-使用双平台法获得各细胞亚群的绝对计数

 

 

测试精度

将来自12名健康供体的样本各分成三份，由两名操作员在三天内分别进行三次重复检测。数据显示高度一致的染色模式，证实了该方案具有很好的可重复性和检测精度。下图展示了其中5个样本的三次检测结果的比较。（图4）

 

 

图4-三次重复检测结果高度一致

 

对比12例样本三次重复检测所获得的CD45+白细胞亚群和淋巴细胞亚群的结果显示，除罕见的CD34+ HSC外，CD45+ WBC的平均%CV在10%以内，淋巴细胞的平均%CV值也都在10%以内。（图5）

 

 

图5-12例样本三次检测的各细胞亚群%CV

 

最后，研究团队还对比了不同样本制备情况下的结果，发现免洗（LNW），洗涤后，及固定破膜处理后的样本，均可获得相似的检测结果（图6）。证实不同样本制备方式不会影响实验结果。

 

 

图6- 不同样本制备情况下的结果可比

 

 

结   论

随着全光谱流式细胞术的出现，高参数流式细胞检测检测变得容易，在单个试管中同时检测更多白细胞亚群已经成为可能。Cytek开发的一种15色Cytek^®cFluor^®人泛白细胞（LNW）检测方案，可以准确地鉴别超过20个主要的白细胞亚群，与传统的CBC和 6C TBNK检测方法相比，具有相似的白细胞亚群百分比，结果一致。与血细胞分析仪结合使用，还可以获得各细胞亚群的绝对细胞计数。

重复试验证实，该检测方案具有高度可重复性（低%CV）。试剂具有高度兼容性，可与EDTA，肝素，ACD和Cyto-Chex^®抗凝管收集的样本兼容，也可与裂解洗涤和细胞内染色方案兼容。

终上，Cytek^®15色人泛白细胞亚群检测方案为研究者提供了一个强大的工具，可以提供比传统CBC或6C TBNK方法更为全面和完整的白细胞计数。

 

 

参考资料：

Xiaoyang Wang, Yoshinori Fukazawa, Ivette Amador, Chris Fleming, Jingyi Chen, Jun Deng, and Mark Edinger, A High Parameter Flow Cytometric Assay to Accurately Enumerate Leukocyte Subsets in Peripheral Blood.

 

 

关于Cytek

About Cytek /

 

Cytek Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling™，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器 —— Aurora和Northern Lights™分析系统、Aurora CS分选系统，Amnis®和Guava®品牌下的流式细胞仪和成像产品，以及试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。

更多的相关信息，请登录Cytek的官方网站：www.cytekbio.com和www.cytekbio.com.cn。

注：Cytek^®, Tonbo Biosciences, cFluor^®, Full Spectrum Profiling™, FSP™和Northern Lights™是Cytek Biosciences, Inc. 的商标或注册商标。Cytek^®全光谱检测技术相关专利包括但不限于：US10739245B2，US11169076B2，US10788411B2。

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