Big Panel Theory系列之—41色小鼠淋系/髓系细胞分析方案

针对小鼠感染性疾病模型的免疫应答研究，德国Bernhard Nocht热带医学研究所Jacobs团队的研究者利用5激光Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪搭建了小鼠41色淋巴/髓系细胞高维分析方案，实现了淋巴/髓系细胞亚群的全面分析，并深入探索了T细胞活化、分化、效应、耗竭表型，以及抗原呈递细胞表面共抑制分子配体的表达。该研究成果作为首/个小鼠40+色高维流式分析方案，于2023年5月发表于流式领域顶刊Cytometry Part A（OMIP-93）。

 

图1. OMIP-93,41色小鼠淋巴/髓系细胞高维分析方案

 

 

研究方案

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该研究使用健康/感染伯氏疟原虫（PbA）的C57BL/6J小鼠脾脏样本进行方案优化和数据展示。41色方案标志物选择如图2所示，其中包含多种谱系标志物用于CD4/CD8+ T细胞、调节性T细胞、γδT细胞、NKT细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞的区分，并重点关注了T细胞活化、分化、效应、共抑制标志物及配体的表达水平。

 

图2. 小鼠淋巴/髓系细胞高维分析方案标志物选择

 

该方案配色流程参照Cytek研发团队发表的40色PBMC高维方案（OMIP-69）完成，并充分考量了染料亮度与标志物表达量、扩散误差与标志物共表达的匹配。方案搭建过程中，研究人员使用了Cytek^® Spectrum Viewer工具（现已整合至Cytek^® Cloud），通过染料相似指数、方案复杂指数评估方案可行性，并为方案的优化提供参考。

 

图3. 41色方案染料光谱特征及相似指数、复杂指数评估

 

 

数据赏析

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为增加数据的可读性，研究人员设计了直观的手动圈门策略以利用谱系标志物进行细胞类群区分（图3）。细胞经去黏连、排除死细胞后，由CD45确定白细胞群体，并依次区分B细胞（CD19+）、嗜酸性粒细胞（SSC^HighF4/80+CD11b+）、γδT细胞（CD3+TCRγδ+）。随后在CD3+TCRγδ-群体中区分NKT细胞（CD3+NK1.1+）、CD4/CD8T细胞、Treg细胞（CD25+FoxP3+）。中性粒细胞由CD11b+Ly-6G+鉴定，巨噬、单核细胞由CD11b+F4/80+区分，并根据Ly-6C的表达区分为经典Ly-6C^High炎性单核细胞和非经典Ly-6C^Low组织驻留单核细胞。对于DC细胞，由于其标志物CD11c在T、B、NK细胞中可能存在的共表达，需排除上述群体后圈门，随后根据Siglec-H、CD11b、MHCII的表达分别区分pDC、cDC1、cDC2群体。

 

图4. 小鼠淋巴/髓系细胞高维分析方案圈门策略

 

健康/感染小鼠CD4/CD8T细胞的活化/分化(CD44、CD62L、CD127、CD69、CD27等)、效应（Granzymme B、Preforin）、共抑制分子（PD1、LAG-3、CTLA-4、CD160）、耗竭（CD33、PD-L1、PVR等）标志物表达对比如图4所示。由于该方案基于小鼠感染PbA模型搭建，方案中多种共抑制分子的高表达已在该团队早期研究中得到证实。得益于Cytek® Aurora全光谱流式细胞仪优异的检测灵敏度，多种弱表达标志物与背景清晰区分。

 

图5. 健康/感染小鼠T细胞活化、分化、效应、共抑制标志物

及配体的表达水平对比

 

 

总结

该研究工作搭建并验证了首/个40+色小鼠淋巴/髓系细胞全光谱流式分析方案，在单管样本中实现了小鼠免疫图谱的高维表征。虽然方案基于小鼠感染性疾病模型的搭建，但全面的标志物选择使其可以直接应用于如肿瘤或自身免疫性疾病等模型研究。文章中关于手动圈门、标志物选择、方案优化策略的清晰描述也为研究人员开展小鼠高维流式分析提供了重要的学习资源，更多方案详情，欢迎参考文章原文。  

参考文献

Brandi J, Wiethe C, Riehn M, et al. OMIP‐93: A 41‐color high parameter panel to characterize various co‐inhibitory molecules and their ligands in the lymphoid and myeloid compartment in mice[J]. Cytometry Part A, 2023.