背 景

流式细胞术是识别和监测体液免疫疾病患者和接受B细胞免疫治疗患者的B细胞亚群的非常有价值的工具。2022年12月，Cytek^®推出了cFluor^®人B细胞监测试剂盒（2激光13色），用于在Cytek®全谱细胞仪系统（2激光及以上）上评估B细胞谱系亚群。该方案可用于识别浆细胞，naïve和记忆B细胞，及T细胞亚群，还包含了从淋巴细胞门中排除单核细胞和粒细胞的检测标记。（表1）

 

表1- Cytek^® cFluor^® 人B细胞试剂盒

（a）检测标记及（b）识别的细胞亚群

 

方法验证

方案验证采用的样本包括EDTA、Cyto-Chex^®BCT和肝素管采集的健康供体PBMCs和全血样本。验证内容主要有细胞亚群检测效果，精密度测试，不同采集来源样本的稳定性，以及试剂预混液的稳定性等。

 

 

验证结果

 

细胞亚群的检测效果

使用13色cFluor^®人B细胞方案，无论是全血样本还是PBMCs样本，都可以将感兴趣的B细胞亚群很好的鉴定出来。

 

方案的设门策略如下：

 

1. 排除粒细胞和单核细胞，以保证淋巴细胞门相对干净。

2. 将淋巴细胞分为CD3+细胞和CD19+淋巴细胞。

3. 将T细胞分为CD4+和CD8+亚群。

4. 从CD19+ B淋巴细胞中，选择CD19+CD20+细胞用来鉴定幼稚（CD27-）和记忆（CD27+）B细胞亚群。

5. 用CD27和IgD鉴定幼稚（CD27-IgD+）、类别未转换记忆（CD27+IgD+）、类别转换记忆（CD27+IgD-）、和双阴性（DN ）B细胞（CD27-IgD-）。

6. 从CD27+ B记忆细胞中，利用IgG和IgM或IgD分别标记记忆IgG类别转换（IgM-IgG+, |gD-IgG+）和记忆类别未转换（IgM+IgG-, |gD+IgG-）细胞。

7. 从CD19+ B淋巴细胞中，选择CD20-CD38++细胞来鉴定B前体（CD27-CD38++）和浆细胞（CD27+CD38++）。

 

全血样本（肝素管）和PBMCs样本的检测效果分别如图1&2所示。

 

图1-肝素管采集的全血样本中的B细胞谱系亚群

 

图2-冻存PBMCs样本中的B细胞谱系亚群

 

精密度测试

 

利用肝素管采集的10例供者全血样本进行测试。将样本各分为三份进行处理，由2名操作人员在4天内完成获取。重复性试验结果显示，在10个样品的3次重复检测中，包括记忆B细胞亚群的B细胞亚群分布模式匹配。，计算每个供体样本的三次重复检测的细胞亚群比例（%population）中的变异系数（%CV），并计算10例供体%CV的平均值，结果显示所有靶细胞群的平均CV值低于15%。（图3）

 

图3-精密度测试结果

 

不同采集来源样本的稳定性

 

将EDTA、肝素和Cyto-Chex^®管中采集的全血样本，分别在采集后6 (0h)、24和48小时（仅Cyto-Chex^®管）进行染色。除浆细胞外，所有样本类型在测试时间点的细胞亚群模式和比例保持一致。在24h时间点，EDTA和肝素样本中的浆细胞比例平均下降约~50%。而Cyto-Chex^®管采集的血液样本在采集后24h和48h时间点的浆细胞比例变化较小。对于Cyto-Chex^®试管，在24和48h时间点，IgG+ B记忆细胞的分辨率稍稍减弱，表现在IgG cFluor^®R668细胞群向上移动（箭头），但IgG+记忆B细胞亚群比例在各时间点保持一致。（图4）

 

图4-不同采集来源的血液样本稳定性测试

试剂预混液（cocktail）的稳定性

 

按每个抗体每次用量5ul，将13色试剂进行预混，并放在2-8℃中保存1、2、3和4周。然后将这些保存的预混液与新鲜配置的试剂混合液进行对比，发现预混液（1-4周）的阳性群体中位荧光强度（MFI）与新鲜配置的混合液（fresh）的MFI值相似；利用3例肝素管采集的供者全血样本进行检测，结果也显示一致的细胞群体模式和比例。（图5）

 

图5-试剂预混液（cocktail）的稳定性测试

结 论

系列实验证实，Cytek^® cFluor^® 人B细胞监测试剂盒（2激光13色），可有效的鉴定和监测血液中B细胞亚群，是监测体液免疫紊乱患者或接受抗B细胞免疫治疗的患者B细胞亚群的有用工具。 血液样本稳定性测试提示，EDTA和肝素样本应新鲜使用，因为在采集后24小时内约有50%的浆细胞可能丢失，而Cyto-Chex® BCT样本可在采集后48小时内使用。同时，稳定性测试显示，13色试剂的抗体预混液可在2-8℃的黑暗环境中稳定保存长达1个月，这将大大提升实验的操作效率。