继2023年5月发表的首/个小鼠41色高维流式分析方案OMIP-093，3个月后，来自美国斯坦福大学Katherine W. Ferrara的团队另一篇40色小鼠6种组织全光谱流式分析方案OMIP-095重磅发表。OMIP（Optimized Multicolor Immunofluorescence Panel）是流式领域知名期刊Cytometry Part A旗下特刊，该系列80%以上是围绕人的样本设计多色方案，这两篇关于小鼠的全光谱流式文章填补了之前小鼠精细免疫分型方案的空白。OMIP-095聚焦小鼠6种淋巴组织，深度剖析了淋系和髓系细胞的免疫表型和功能性亚群，高维度的方案设计思路具有重要的应用参考价值。

 

研究方案

 

基于Cytek^® Aurora全光谱流式平台，研究人员设计了5激光40色的C57BL/6小鼠脾脏、外周血、骨髓、胸腺、腹股沟淋巴结和派伊尔结（Peyer’s Patches）6种组织精细免疫分型方案。方案中全部涉及表染指标，可以直接对接下游功能性实验或多组学分析。

 

40色小鼠精细免疫分型方案

分析策略

 

以脾脏为例，基于14个谱系标志物可以初步从白细胞中圈选出主要细胞亚群，包括T、B、NK、髓系（DC、单核、巨噬细胞）和粒细胞（中性、嗜酸性和嗜碱性粒细胞）。

首先通过散射光信号和活性染料圈走碎片、死细胞和黏连体。CD45+圈出白细胞，CD45R（B220）和CD19区分B-1和B-2细胞，NK1.1和CD3ε依次圈出NK和T细胞。根据F4/80和Ly6G识别巨噬细胞和中性粒细胞，经典单核细胞由CD11c+I-A/I-E (MHCII)+进行表征。Siglec-F和FcεR1α圈出嗜酸性和嗜碱性粒细胞，再由CD11b和CX3CR1区分单核细胞。

进一步，CD45R+CD19+B-2细胞细分出滤泡、过渡、边缘区和生发中心四个亚群。CD3ε+T细胞可分成非传统T细胞（γδT, γδNKT, NKT），CD4+Treg富集细胞群，CD4/CD8α效应记忆、中心记忆、天然和双阴性细胞群。通过CD127和CD44圈走ILC1s后，NK细胞根据CD27和CD11b可以分为4个不同的成熟阶段。在CD19-CD45R+细胞群中，用Siglec-H和NK1.1区分pDC和pre-mNK。经典DC利用CD11b和CD8α分成cDC1和cDC2，单核细胞借助Ly6C和CD62L进一步细分为成经典、中间和非经典三群。

 

小鼠脾脏免疫细胞手动圈门策略

 

上述门控策略可以同步应用到小鼠其他组织样本中。基于OMIQ分析平台，小鼠次级淋巴组织CD45+白细胞的数据，采用UMAP降维分析进行直观展示。经过传统圈门策略细分出的35个细胞亚群，叠加到UMAP图上，可以横向比较4种次级淋巴组织之间35个细胞亚群的丰度。

 

小鼠次级淋巴组织UMAP高维数据分析

 

小鼠脾脏、外周血、骨髓、胸腺、腹股沟淋巴结和派伊尔结6种组织同时用UMAP结果呈现，所有小鼠初级和次级淋巴组织的细胞亚群得以在一张图上实现可视化。另外，每种组织对应的UMAP热图结果进行平行对比，基于谱系标志物界定的细胞亚群，在不同组织之间分布的差异得到清晰的区分。

 

小鼠初级和次级淋巴组织UMAP结果可视化

方案搭建过程中，研究人员借助Cytek^® Spectrum Viewer工具，基于染料相似指数（Similarity^TM Index，数值0~1）评估方案可行性。方案中染料组合最高相似指数为0.94，在Cytek^®全光谱流式细胞仪建议的0.98相似指数范围内。方案设计工具已被全部整合在Cytek®Cloud平台，并集成了Full Spectrum Viewer，Panel Builder, Experiment Builder三大模块，内置了目前已发表的所有OMIP方案库。Cloud平台从多色配色到一键导出实验模板，实现方案设计到数据采集的无缝衔接。

目前Cytek^® Cloud平台已面向所有Cytek光谱流式用户开放，欢迎访问：http://cloud.cytekbio.com，免费注册您的专属账户。

 

40色方案染料相似指数评估

亮点总结

 

OMIP-095在小鼠精细免疫分型研究领域具有里程碑意义，方案设计思路从横向囊括6种小鼠初级和次级淋巴组织，到纵向深度表征多达40种免疫细胞指标。方案涉及的广度和深度提供了高度的普适性，可广泛应用于肿瘤免疫、感染免疫、临床前研究、方法学探索等不同场景。其中包含的14色骨架方案，既可以单独用于分析次级淋巴组织中淋系和髓系的主要细胞亚群，还可以进一步优化拓展为新的全光谱流式方案。文章53页的补充材料提供了详实的方案优化策略，感兴趣的老师们可以下载阅读。

参考文献

Kare, A. J. et al. OMIP-095: 40-Color spectral flow cytometry delineates all major leukocyte populations in murine lymphoid tissues. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 103, 839-850, doi:10.1002/cyto.a.24788 (2023).