研究亮点

 隐孢子虫病是一种以腹泻为主要临床表现的人兽共患原虫病，部分种属的隐孢子虫感染免疫力低下者或者幼龄儿童后，可能会引起剧烈的反应，严重者甚至造成死亡。研究人员利用微小隐孢子虫（C. parvum）特异的抗体Sporo-Glo™标记被感染的宿主细胞，借助流式技术搭建了体外检测平台，探索隐孢子虫的宿主感染机制。有趣的是，研究人员发现被感染寄生虫的细胞能够产生特异的自发荧光。通过全光谱流式细胞仪对自发荧光光谱进行扫描，开创性地实现了无需标记抗体，直接利用自发荧光对于隐孢子虫的感染周期进行示踪。

研究背景

隐孢子虫病是一种世界性的人畜共患病。隐孢子虫为体积微小的球虫类寄生虫，根据目前报道，主要以微小隐孢子虫（C. parvum）和人隐孢子虫（C. hominis）两个种属对人存在致病性。针对于不同种属的隐孢子虫的感染机制探讨，此前局限于缺乏高效的体外评估模型。基于人食管鳞状癌细胞COLO-680N模型，能够在体外重现隐孢子虫的完整生命周期。抗体Sporo-Glo™标记隐孢子虫，应用流式细胞技术能够评估寄生虫的感染能力，但是该方法受限于抗体特异性和检测分辨率。文章中研究人员首次基于全光谱流式平台，在不标记抗体的情况下，直接利用自发荧光信号追踪寄生虫感染宿主细胞的生命周期。

 

隐孢子虫的卵囊图示1

 

研究结果

 

Sporo-Glo™抗体标记

隐孢子检测感染力

COLO-680N宿主细胞是一个理想的体外模型，能够示踪隐孢子虫的感染生命周期。隐孢子虫感染COLO-680N宿主细胞后，通过传统流式的散射光信号能够分别圈选出细胞和隐孢子两群，从隐孢子门内可以再细分出卵囊、子孢子和外壳。结合C. parvum特异抗体Sporo-Glo™，能够区分被隐孢子感染的细胞。当更高滴度的隐孢子感染细胞后，Sporo-Glo™阳性率随之提高，并且，C. parvum感染后COLO-680N宿主细胞的阳性显著强于C. hominis。

 

Sporo-Glo™检测隐孢子虫感染宿主细胞水平

 

发现全新自发荧光Sig M

可用于指示寄生虫感染

研究人员在检测COLO-680N感染寄生虫的Sporo-Glo™信号时，偶然间发现细胞的自发荧光有显著提升，这个自发荧光信号跨越了传统流式的各个检测通道。在没有染色Sporo-Glo™的被感染的COLO-680N细胞中，也同样观察到该自发荧光信号的存在，排除了该信号是由于Sporo-Glo™染色带来的荧光溢漏。研究人员将这一新发现的自发荧光信号命名为Sig M。Sig M对于Sporo-Glo™的FITC荧光（488nm激发/527nm接收）存在干扰，从而引起Sporo-Glo™本底提高，降低了检测的分辨率。为了排除FITC仅仅是来源于Sig M信号或者Sporo-Glo™非特异结合产生的背景，文中比较了Sig M阳性和阴性的细胞群分别对应的FITC通道下荧光强度的比值，发现感染C. parvum的宿主细胞在没有染色Sporo-Glo™时，比值随着感染滴度增加不会发生变化，但在加入Sporo-Glo™之后比值变高，并且随着感染滴度增加数值也随之上升，说明Sporo-Glo™抗体结合的正是被寄生虫感染的Sig M阳性的细胞。但是，在C. hominis感染的细胞中，则没有看到类似的比例升高。提示Sporo-Glo™无法特异性检测C. hominis感染。

 

自发荧光Sig M指示隐孢子感染宿主细胞

 

全光谱流式“看清”被感染细胞的

Sig M自发荧光光谱

基于全光谱流式检测平台，研究人员对比了未感染的细胞、感染隐孢子虫的Sig M阳性和阴性细胞、以及隐孢子卵囊对应的自发荧光光谱，比对后发现未感染细胞和Sig M阴性细胞光谱形状一致，不同种属寄生虫感染后细胞光谱也相同，并且Sig M阳性细胞和寄生虫卵囊光谱相近，证明宿主细胞Sig M光谱信号与隐孢子虫相关。不同滴度隐孢子虫感染宿主细胞后，Sig M荧光光谱信号随之发生改变，对照组鼠伤寒/沙门氏菌感染细胞后Sig M则为阴性，进一步佐证Sig M光谱可应用于特异检测隐孢子感染COLO-680N宿主细胞的水平。数据分析时利用全光谱流式提取自发荧光的功能，进一步提高了Sig M的检测分辨率，也为Sig M和Sporo-Glo™同时检测提供了更好的选择。

 

Sporo-Glo™检测隐孢子虫感染宿主细胞水平

总结展望

Sporo-Glo™抗体检测隐孢子虫感染宿主细胞是比较经典的方法，研究人员在检测宿主细胞感染时偶然发现，寄生虫感染会引起细胞自发荧光提高，并将这一特异的自发荧光信号命名为Sig M。全光谱分析型流式细胞仪Cytek^® Aurora能够一览Sig M荧光光谱全貌，无需抗体标记，仅借助自发荧光即可特异性评估隐孢子虫感染宿主细胞的能力。该检测平台还能够应用于隐孢子虫病药筛评价，以及水环境中寄生虫卵囊的监测等方向。全光谱分选型流式细胞仪Cytek^® Aurora CS™还能进一步分选出Sig M阳性的细胞，对接下游显微成像或者基因定量检测等应用。Aurora CS搭载专利全光谱技术和高端分选技术，卓越的灵敏度和自发荧光提取功能为单细胞分辨率带来质的飞跃。内置HEPA过滤器，防止气溶胶污染，也可以搭配生物安全柜使用，为操作人员的生物安全防护保驾护航。

 

参考文献

1Xiao, L., Fayer, R., Ryan, U. & Upton, S. J. Cryptosporidium taxonomy: recent advances and implications for public health. Clinical microbiology reviews 17, 72-97, doi:10.1128/cmr.17.1.72-97.2004 (2004).

2Ogbuigwe, P. et al. A novel, stain-free, natural auto-fluorescent signal, Sig M, identified from cytometric and transcriptomic analysis of infectivity of Cryptosporidium hominis and Cryptosporidium parvum. Frontiers in cellular and infection microbiology 13, 1178576, doi:10.3389/fcimb.2023.1178576 (2023).