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公司新闻/正文
Big Panel Theory系列之——20色方案描绘肺癌组织的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）表达谱
676 人阅读发布时间：2024-09-15 21:44
研究背景
肿瘤微环境是一个高度复杂的生态系统，也是免疫细胞与肿瘤对峙厮杀的战场，其中，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）扮演着抗肿瘤的“杀手”角色。鉴定、纯化并回输TIL，在肿瘤免疫研究领域中是颇有前景的临床治疗手段。但是，如何从患者肿瘤组织中分离到活性样品，精准定位并获取高纯度的TIL，对于研究人员来说无疑是困难重重。2024年CYTO会议的一篇墙报中展示的解决方案，希望能为研究人员在肿瘤免疫领域的科研探索和临床治疗点燃灵感的火花1。
方案设计
经穿刺活检或支气管镜检获取15份新鲜的肺癌组织样品，低温保存在组织储存液中。将其切成小块后，采用PythoN® 组织解离系统（Singleron Biotechnologies）处理成单细胞悬液。
图1 - 样本制备到上机分析的流程示意图
细胞先采用Cytek® ViaDye Red 活性染料于室温避光染色20 min，清洗细胞后，孵育抗体混合液20 min。PBS清洗后离心去除上清，重悬细胞，使用Cytek® Northern Lights™-CLC（NL-CLC）全光谱流式细胞仪 采集数据。
图2 - TIL全光谱流式20色方案搭配
分析策略
以时间轴圈选液流稳定的细胞群，SSC/SSC-B排除红细胞，FSC-A/FSC-H和SSC-A/SSC-H排除黏连体干扰，ViaDye Red去除死细胞。以CD45表征白细胞，EpCAM识别上皮细胞。CD3/CD4/CD8鉴定T细胞主群，并用记忆和分化指标CD45RA/CD45RO/CCR7进一步细分T细胞亚群。CD19识别B细胞，CD16/CD56定义NK细胞。嗜碱性粒细胞采用CD123和HLA-DR进行区分，单核细胞以CD14和CD16进行鉴别。波形蛋白（Vimentin）是中间丝的其中一种蛋白质，通过参与上皮细胞向间充质细胞类型的转变而增强肿瘤的恶性程度，方案中加入了这一指标来检测波形蛋白的胞外表达。
图3 -肺癌样本TIL手动圈门策略
分别对比了EpCAM+上皮细胞PD-L1以及CD4+/CD8+ T细胞PD-1的表达丰度，15份肿瘤样品中，有13份PD-L1的阳性率超过了5%。部分样品呈现上皮细胞PD-L1高表达，但与T细胞PD-1的高表达趋势并无一致性，反之亦然。
图4 -上皮细胞PD-L1以及T细胞PD-1的表达丰度统计表
研究人员横向对比了15份肺癌样品的细胞亚群分布情况。如图5的左图所示，绿色柱状代表上皮组织细胞比例，橙色柱状表示白细胞比例，15份肺癌样品中，有2份（S11和S13）免疫细胞比例低于10%，推测可能属于冷肿瘤。右图中，评估了白细胞中免疫细胞亚群的分布，其中，最主要的亚群组成是T细胞（右图橙色柱状）。
图5 - 15份肺癌患者样品的主要细胞类型组成
总结展望
相较于在流式实验中普及性更高的外周血样品，实体肿瘤组织的流式实验充满着更多的未知与挑战。酶解组织的处理措施不当，可能对于细胞表面标志物的表达产生影响，从而干扰流式细胞仪结果的判读2。肿瘤微环境高度复杂，需要精准定位到目的细胞，势必离不开高维流式方案的合理搭配。本文从样本制备、方案设计到上机分析给出了一站式的实验流程参考，方案横向比较了肺部肿瘤微环境中的众多细胞类型，也纵向聚焦到细胞亚群的PD-1和PD-L1的表达。由于全光谱流式细胞仪具备方案扩展的潜力，其他的免疫检测点标志物如CTLA4和TIM3等也可以考虑在后续实验中加入3,4。此外，全光谱分析和分选平台可以实现方案的无缝衔接，因此，方案能够直接平移到Cytek® Aurora™ CS全光谱流式细胞分选仪，对于感兴趣的细胞如TIL进行分选，再对接下游功能性实验，为肿瘤患者的临床治疗开拓更多维度的研究思路和方向。
参考文献
1. Weide Ma, Y., Danqi Yue, Keon Anderson, DongdongChu, YaxuanZhang, Long Zhang, Jun Deng, Mark Edinger, Xiaoyang(Alice) Wang. Twenty-Color Immuno-Analysis Of Tumor-InfiltratingLymphocytes (TIL) In Lung Cancer. (2024).
2. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C. & Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp) 2, 112-120, doi:10.1556/EuJMI.2.2012.2.3 (2012).
3. Wang, D.-R., Wu, X.-L. & Sun, Y.-L. Therapeutic targets and biomarkers of tumor immunotherapy: response versus non-response. Signal Transduct Target Ther 7, 331, doi:10.1038/s41392-022-01136-2 (2022).
4. Fameli, A. et al. PD-1/PD-L1 immune-checkpoint blockade induces immune effector cell modulation in metastatic non-small cell lung cancer patients: A single-cell flow cytometry approach. Frontiers in oncology 12, 911579, doi:10.3389/fonc.2022.911579 (2022).