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公司新闻/正文
小颗粒，大细胞，尽在掌握--全光谱流式细胞仪在细胞外囊泡研究中的应用
623 人阅读发布时间：2025-06-23 16:04
什么是细胞外囊泡（EVs）？
细胞外囊泡过去被误认为是细胞碎片，伴随着生物学技术的发展，研究人员逐步认识到，EVs实际上是由细胞主动释放到胞外环境的膜包被颗粒，其携带蛋白质、脂质和核酸等生物分子，在细胞间通讯、物质运输和免疫调节等生理和病理过程中发挥着重要作用，在近年来更是成为生命科学领域的研究热点。根据其大小和形成机制，EVs主要分为以下三类：
外泌体：30-100 nm，起源于内吞作用，通过多泡体（MVB）与细胞膜融合释放；
微囊泡：100-10000 nm，由细胞膜直接出芽形成；
凋亡小体：1000-5000 nm，细胞凋亡时膜破裂释放而形成。
图1 - 细胞外囊泡根据大小和形成机制细分为3类1
Cytek开启了全光谱流式细胞仪
在微观世界的大门
流式细胞仪最早是基于检测细胞而设计和优化的，其高通量、多参数等优势与复杂多变的免疫系统相得益彰。但细胞外囊泡颗粒小，散射光信号微弱，表面分子数量极少，对于流式细胞仪的灵敏度提出了更高的要求。Cytek®全光谱流式细胞仪的问世，让研究者们看到了灵敏度质的飞跃，也开启了利用全光谱流式细胞术探索微观世界的大门。小至70 nm的颗粒无需荧光标记即可在Cytek全光谱流式细胞仪上被识别检测，使科研人员能够表征小颗粒的完整发射光谱信号，探索以前无法触及的领域。
图2 - Cytek全光谱流式细胞仪轻松兼容纳米颗粒与细胞检测
Cytek全光谱流式细胞仪检测EVs的应用方向
Cytek全光谱分析型与分选型流式细胞仪标配紫光侧向散射（SSC）与蓝光侧向散射（SSC-B）双检测器，能够同时兼容纳米颗粒与细胞的检测。基于全光谱流式细胞仪检测细胞外囊泡，常见的应用有：1）通过直标法检测EVs单颗粒，2）通过微球法检测特异性结合微球的EVs群体， 3）检测EVs介导的免疫细胞表型与功能动态改变。
一 直标法高清识别EVs单颗粒
细胞外囊泡标记特异性荧光抗体、荧光染料或荧光蛋白，采用Cytek全光谱流式细胞仪能够实现单颗粒水平的异质性EVs识别与检测。来自德国曼德姆大学医院的研究人员使用Cytek Northern Lights™全光谱流式细胞仪分析头颈部癌症患者与健康人的唾液中的小细胞外囊泡（SEVs，30-150 nm）表面的免疫调节蛋白表达丰度异质性，并对EVs浓度实现免微球绝对计数。
图3 – 对比头颈部癌症患者与健康人SEVs表面蛋白2
来自美国弗吉尼亚州大学运动学系的研究团队，对于人类血浆不同来源的EVs进行免疫分型，通过Cytek Aurora™全光谱流式细胞仪清晰分辨出内皮细胞（CD105+，CD41-/CD31+）、白细胞（CD45+）、血小板（CD41+）、四跨膜蛋白（TX+，CD9/CD81/CD63）以及血小板内皮细胞粘附分子（CD31+）来源的EVs3。并且，通过FCMPASS软件建立了EVs散射光强度与粒径的工作曲线，实现EVs粒径的量化分析4。
图4 - Cytek 全光谱流式细胞仪可清晰分辨不同来源EV
二 微球法量化EVs表面标志物表达
捕获微球通过表面偶联EVs特异性抗体，与EVs组分孵育结合后，再加入荧光抗体标记，从而实现对EVs群体表面标志物的检测。而通过设计双色荧光且荧光强度各异的捕获微球，可以实现多重免疫捕获。以MACSPlex Exosome Kit为例，通过FITC/PE双荧光强度差异，可区分出39种微球，单次实验即可同时分析37种EVs标志物（以及2种对照）。通过多重微球阵列捕获人类脑脊液、血浆、血清、以及体外培养细胞系等不同来源的EVs，再采用Cytek全光谱流式细胞仪进行高分辨率数据呈现，构建出量化EVs表面标志物高通量、多参数的完整解决方案。Cytek全光谱流式细胞仪搭载自动化进样装置，能兼容96孔板、384孔板、40孔流式管架，实现无人值守全自动数据采集，软件光谱解析和传统补偿的“双引擎”模式一键式轻松切换，双模式均能完成上述方案的检测。
图5 - 基于微球法量化检测EVs标志物的完整解决方案5
三 检测EVs介导的免疫靶向及调节功能
EVs作为细胞间通讯的关键媒介，在免疫微环境中对免疫细胞进行精准靶向与动态调控。美国密歇根州立大学自然科学学院研究团队采用亲脂性荧光染料PKH26标记胎盘来源的EVs，注射到小鼠体内，之后再取其肺部组织处理成单细胞悬液，抗体染色后采用Cytek Aurora全光谱流式细胞仪检测了巨噬细胞中EVs的表达情况，通过特色的自发荧光提取功能显著性提升了单细胞检测的分辨率。该方案还可进一步扩展，以监测EVs介导的免疫微环境动态改变。Cytek 全光谱流式细胞仪同时兼容细胞与外囊泡的检测，满足更多元的应用场景需求。
图6 – 追踪EVs靶向免疫细胞6
总结展望
纵观全光谱流式技术的应用成果，基于Cytek全光谱分析（FSP™）技术发表的文献数量一直以断层式优势稳居榜首。在细胞外囊泡的研究领域，Cytek流式细胞仪同样展现出相较于传统流式细胞仪的显著性优势，具备灵敏度、极大的灵活性和可扩展性，能够兼容EVs与细胞的检测，兼容光谱解析与传统补偿“双引擎”模式，兼容简单少色到复杂高维的多场景应用，还能够兼容分析到分选的实验需求。值得一提的是，Cytek FSP平台还可进一步拓展至其他小颗粒领域的研究，如病毒、小细菌、纳米颗粒和其他亚细胞颗粒等，在纳米级微观维度展现出无限的应用潜力。
图7 – Cytek FSP平台在细胞小颗粒领域的应用潜力
参考文献
1György, B. et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and molecular life sciences : CMLS 68, 2667-2688, doi:10.1007/s00018-011-0689-3 (2011).
2Tengler, L. et al. Optimization of extracellular vesicles preparation from saliva of head and neck cancer patients. Scientific Reports 14, 946, doi:10.1038/s41598-023-50610-6 (2024).
3Heiston, E. M. et al. Acute exercise decreases insulin-stimulated extracellular vesicles in conjunction with augmentation index in adults with obesity. The Journal of physiology 601, 5033-5050, doi:10.1113/JP282274 (2023).
4Heiston, E. M. et al. Insulin infusion decreases medium-sized extracellular vesicles in adults with metabolic syndrome. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 323, E378-E388, doi:10.1152/ajpendo.00022.2022 (2022).
5Welsh, J. A. et al. MPAPASS software enables stitched multiplex, multidimensional EV repertoire analysis and a standard framework for reporting bead-based assays. Cell reports methods 2, 100136, doi:10.1016/j.crmeth.2021.100136 (2022).
6Nguyen, S. L. et al. Integrins mediate placental extracellular vesicle trafficking to lung and liver in vivo. Scientific Reports 11, 4217, doi:10.1038/s41598-021-82752-w (2021).