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公司新闻/正文
多重自发荧光提取三大挑战，AF Explorer见招拆招，一键破局
282 人阅读发布时间：2025-09-04 15:21
自发荧光的困局
自发荧光（Autofluorescence，AF）是指由内源性细胞成分发出的任何荧光，其来源包括细胞中的结构蛋白如胶原蛋白和弹性蛋白、细胞器如溶酶体和线粒体、代谢物如环状化合物和芳香氨基酸等，荧光强度会随着细胞大小、颗粒度、代谢状态或者实验条件等发生改变。使用传统流式细胞仪时，遇见AF常常需要“绕道而行”，通过选择红光或远红光的荧光染料，避开常见于短波长范围的AF，但方案搭配就会因此受限；或者通过降低检测通道电压，从视觉上减少AF的对流式结果影响，但是数据分辨率便会随之受到影响。更有甚者，由于传统流式只能看到发射光谱的“冰山一角”，对于自发荧光的检测可能存在盲区，带来迷惑结果的误判（图1）。
图1 – 小鼠肺泡巨噬细胞中，（右上图）阳性信号被高AF掩盖，造成误判1
全光谱流式拨开AF的迷雾
Cytek全光谱流式细胞仪搭载专利的全光谱分析（Full Spectrum Profilling™，FSP™）技术，荧光发射光谱全貌一览无余，对于自发荧光的光谱亦能尽收眼底，同时让多重自发荧光信号在光谱图上实现了可视化呈现。相较于仅一种特征的自发荧光光谱，异质性样本的多重自发荧光提取难度大幅提升,对于软件的数据分析功能提出了更高的挑战。
对于AF带来的诸多挑战，Cytek向我们的用户提供了符合多场景应用的灵活分析策略，并在SpectroFlo/SpectroFlo CS新版软件中推出Autofluorescence (AF) Explorer，一键解决AF带来的困扰，下面，我们一起来看看采用常规操作与采用Cytek AF Explorer在解决AF问题的不同体验。
常规操作
(可能遇到的挑战）
挑战 1：鉴定（Discover）多重自发荧光的每一种光谱特征
在处理异质性AF样本时，第一个挑战在于需要精确识别出未染样本中存在的每一种独特的自发荧光光谱。常见的鉴定方法有三种：
-
基于N×N或N×1二维散点图分析光谱原始数据，荧光通道两两组合以圈选自发荧光亚群（图2A）；
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先解析数据，再将软件提取的AF与其他荧光通道组合，以圈选出自发荧光亚群（图2B）；
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采用第三方软件对光谱原始数据进行降维聚类可视化分析，细分出自发荧光亚群（图2C）。
图2 – 三种策略鉴定小鼠脾脏样本的异质性自发荧光2
挑战 2： 判定（Distinguish）AF的去和留
接下来的挑战在于需要准确判定其是否被保留并应用于后续光谱解析。通常遵循的原则是相似指数（SI）≤0.98时，即可判定为AF光谱之间存在足够差异，可予以保留（图3）。
图3 – 根据相似指数判定AF去留3
挑战 3： 指定（Designate）筛选出的AF应用于数据解析
基于上述策略筛选出AF，需要作为参考对照组纳入到实验模板中，同时结合其他单染管数据实现多色样本的光谱解析，最终评估加入的AF对于整体方案的影响（图4）。
图4 – 提取AF后数据分辨率显著性提升3
Cytek Autofluorescence Explorer
化繁为简，一键破局
多重自发荧光提取面临的三大挑战，即精确鉴定（Discover）AF光谱特征—准确判定（Distinguish）AF去留--指定（Designate）AF应用于数据解析。这三大挑战在Cytek全光谱流式细胞仪（包括全光谱流式分析仪和分选仪）软件的Autofluorescence (AF) Explorer功能中，一招尽数破解（图5）。操作人员仅需一键式点击，即可自动化完成多重自发荧光的识别和提取，软件引导式的操作界面，严谨可视化的数据质控，化繁为简，带来更客观、真实、准确的数据分析结果，让数据质量获得质的飞跃。
图5- AF Explorer一键破局三大挑战
自发荧光亦敌亦友，Cytek全光谱流式细胞仪可以一招制敌，相反也可以与之和谐共处，直接利用自发荧光实现免抗体标记分析分选目的细胞，欢迎点击往期推文，领略Cytek全光谱流式细胞仪与自发荧光的更多精彩故事。
参考文献
1Jameson, V. J. et al. Unlocking autofluorescence in the era of full spectrum analysis: Implications for immunophenotype discovery projects. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 101, 922-941, doi:10.1002/cyto.a.24555 (2022).
2Pilkington, K. R. Autofluorescence: From burden to benefit. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 105, 563-567, doi:10.1002/cyto.a.24885 (2024).
3Roet, J. E. G. et al. Unbiased method for spectral analysis of cells with great diversity of autofluorescence spectra. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 105, 595-606, doi:10.1002/cyto.a.24856 (2024).