Amnis®成像流式联手Nanovial技术，开启单细胞分泌分析新纪元，不止捕获更能“看见”

I. 识别B细胞亚群分泌的IgG抗体

图2A展示了流式检测捕获B细胞及其分泌物的Nanovials颗粒的散点图，未设门的蓝色群体是未装载细胞的Nanovials，紫色群体则为装载了CD38阳性并且IgG分泌较低细胞的Nanovials，绿色群体则是装载了CD38阳性且IgG分泌较高细胞的Nanovials（图2A）。Amnis^®成像流式系统捕获的CD38^{细胞群体图像如图2B所示。Nanovials捕获的IgG强度使用蓝色复合Mask计算（采用明场Mask，排除CD38 Mask），从细胞外IgG强度中扣除细胞表面的IgG成分，检测该图像内的IgG总强度（图2C）。}

图2：捕获B细胞和其分泌物的Nanovials颗粒

II. 区分膜结合型与分泌型TNF-α

TNF-α是一种参与免疫细胞通讯和激活的促炎细胞因子，可由巨噬细胞或T淋巴细胞等细胞分泌。TNF-α最初是作为跨膜蛋白（mTNF-α）产生的，它可以被金属蛋白酶酶解从而释放可溶性TNF-α（sTNF-α）。这两种形式的TNF-α可具有不同的生物活性，但很难在单个细胞中检测和区分这两种TNF-α。胞内细胞因子染色无法区分mTNF和sTNF，其他使用细胞因子捕获试剂的方法也不能区分这两种形式的TNF-α。

通过将活化T细胞装载到含有抗TNF-α捕获抗体的Nanovials上，可以对已释放并结合在Nanovials腔内的TNF-α进行检测（见图3A-B）。使用mask工具，可以对细胞结合型（mTNF-α）和Nanovials结合型（sTNF-α）这两种形式分别进行染色，并在单细胞群体水平进行定量分析。因此，该方法可探索TNF-α的不同形式尚未被完全发现的作用，并揭示它与驱动免疫细胞功能的其他关键细胞因子的组合形式。

将T细胞装入包含有TNF-α捕获抗体的Nanovials中，用可溶性因子激活，诱导TNF-α的分泌。用钙黄素AM标记样品以鉴定T细胞，用anti-TNF-α APC标记鉴定可溶性TNF-α。在图3A中，24%的装有T细胞的Nanovials中显示存在可溶性TNF-α。图3B为捕获了活化的T细胞和TNF-α的Nanovials图像，图3C为未活化的T细胞（无TNF-α）的Nanovials图像。

图3：将T细胞装载入Nanovials中，诱导TNF-α的分泌后，进行检测

III. 检测细胞分泌的细胞外囊泡

利用Nanovia技术，可检测单个细胞分泌的细胞外囊泡，避免了传统批量分析中细胞异质性的干扰。将细胞植入Nanovials中，诱导其产生细胞外囊泡。样品用绿色细胞标记物和红色荧光抗体对EV表面蛋白进行染色，利用图2C所示的复合Mask检测捕获的EV强度。图4B显示了Nanovials捕获的高EV分泌的细胞，图4C则为Nanovials捕获的低EV分泌的细胞。

图4：检测Nanovials中细胞分泌的细胞外囊泡