CAR T细胞疗法新突破！4激光36色全光谱流式方案为细胞制备全流程实时“把脉”

肿瘤免疫治疗通过激活或增强机体免疫系统对肿瘤细胞的识别与杀伤能力，达到控制或清除肿瘤的目的，这是一场“武装部队”与善于伪装的“叛乱分子”之间的攻防大战，而免疫疗法之——嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，如同给这支部队配备了导航系统（CAR基因），能够精准击杀带有特定靶点的癌细胞。CAR T细胞在血液系统恶性肿瘤治疗中成效显著，然而，反应的持久性不够稳定，许多患者在治疗后的1年内出现复发。这些疗效结局由肿瘤内在机制、T细胞功能状态以及制备工艺变量等共同决定，而其中，CAR T 细胞制备过程带来的影响往往是易被忽视的因素。

图1 - 嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法示意图¹

以往对于CAR T细胞制备中的质控评估存在两方面的局限性，一是检测参数片面，仅聚焦于例如 CAR 表达、CD4:CD8 比值以及体外细胞毒性等有限参数；二是只看结果，忽视过程，大部分研究仅围绕最终产物评价，未能动态追踪生产过程中的细胞表型与功能性改变。美国南加州大学/洛杉矶儿童医院的Mohamed Abou-el-Enein带领的研究团队，首次使用4激光（V-B-YG-R）Cytek^® Aurora™全光谱流式细胞仪开发了36色的方案，应用于CAR T细胞制备全流程的检测，揭示了关键的生物学动态转变过程，为制备工艺优化与产品设计改进提供了重要依据，该成果发表于医学一区期刊《Molecular Therapy》²。

图2 – CAR T细胞表型及功能性标志物分析框架

研究人员基于4激光Cytek^® Aurora™全光谱流式细胞仪设计了包含36个标志物的方案，涵盖了细胞鉴定、CAR特征分析、谱系归属、代谢、功能及分化状态等关键参数，全景式多维度呈现了CAR T细胞从起始供体样本，经过基因改造、体外扩增到功能验证全过程中的表型动态演变。方案中YFP和GFP报告基因分别示踪CD19⁺ Nalm6-YFP⁺靶细胞与CD19⁻ Nalm6-GFP⁺对照细胞。

图3 – 4激光36色全光谱流式方案信息

采用慢病毒转染，从6名健康供者中制备抗CD19 CAR T细胞，并分别在第0天（转染前）、第5天（扩增中期）和第10天（最终收获）对其表型进行动态追踪（图4A）。通过将第5天和第10天的产物分别与（靶细胞）CD19⁺ Nalm6-YFP⁺细胞以及（对照细胞）CD19⁻ Nalm6-GFP⁺细胞共培养，评估功能性反应。其中三名供体的CAR T细胞产物额外接受了抗原再刺激，以评估重复刺激的影响（图4B）。结果表明，收获时间点决定了最终细胞产物中所富集的细胞状态，中期收获的产物有望在细胞得率与持久治疗潜能之间取得更理想的平衡。

图4 – CAR T细胞制备全流程动态评估

研究人员开发了4激光36色Cytek^® Aurora™全光谱流式方案，针对CAR T细胞制备全流程进行了动态监测，通过整合细胞表型、分化、代谢、活化及功能等多维度特征，全方位揭示了细胞制备条件如何影响与临床疗效息息相关的产品特性。展望未来，将此方案应用于临床研究，有望发现细胞产品表型与患者预后相关联的预测性生物标志物，为下一代细胞产品设计提供前瞻性指导。