从干细胞到早期祖细胞：光谱流式对小鼠造血系统的深度分析

图1. 小鼠造血干细胞和祖细胞的类群层级（A）及已报道的表型特征（B）

图2中展示了8月龄小鼠骨髓细胞的14色造血分析方案圈门策略，并通过t-SNE进行可视化展示。圈定单细胞信号后，选取活细胞亚群中的Lin-群体(Lineage Marker包括Ter119、Mac、Gr1、B220、CD5、CD4、CD8及CD3），并分析c-kit和Sca 1的表达情况。在Linᐨckit ^lowsca 1^low类群中对淋巴样祖细胞（CLP）进行区分；在Linᐨckitᐩsca 1ᐨ（LK）类群中对髓系定向祖细胞进一步分辨；并在Linᐨckitᐩsca 1ᐩ（LSK）类群中精细分析MPP及HSC亚群。除经典分群外，本方案通过信号淋巴细胞激活分子（SLAM，CD48、CD150）发现了一群在骨髓造血组织中具有长效重建潜能的细胞亚群，并将其定义为HSC-SLAM（LSK Flk2ᐨCD48ᐨCD150ᐩ）。

随后，研究人员使用该方案分析了不同生命阶段小鼠造血系统的表型变化（图3）。实验发现2-4周龄小鼠表现出HSC-SLAM及MPP4类群丰度的增加；4周龄小鼠HSCᴸᵀ/HSCᴵᵀ丰度预示其具有成年HSC组成。随年龄继续增长，研究人员发现了以MPP4和CLP丰度逐渐下降为特征的淋巴特异性通路损伤。12月龄小鼠虽表现出表型异质性丧失的HSC-SLAM，且表达HSC衰老相关的CD41。从青壮年至老年的生命阶段中，小鼠造血系统呈现出表型多样性（功能多样性）到表型均一性的发展趋势。

为进一步验证该14色造血系统分析方案的兼容性，研究人员利用该方案检测了Gfi 1-GFP基因敲入小鼠的骨髓样本，通过GFP信号报告Gfi 1（造血系统中影响细胞分化的重要转录因子）的表达。实验结果（图4A）显示Gfi 1的表达在粒细胞-巨噬细胞分化过程中增加，而在红细胞-巨核细胞分化过程中减少；LSK类群也观察到类似的趋势，巨核细胞偏向的MPP2表达Gfi 1低于淋巴细胞偏向的MPP4和髓细胞偏向的MPP3。而Gfi 1的最高表达发生在HSC中最不成熟的HSCᴸᵀ亚群中。值得注意的是，用于报告Gfi 1表达的GFP与方案中CD34-FITC具有极其相似的荧光发射光谱，得益于Cytek全光谱流式强大的光谱解析性能，GFP与FITC得以在同一多色方案中共用（图4B）。

图4. Gfi1在造血干细胞和祖细胞中的表达

作者结合了多个已发表的造血系统多色方案，通过4激光Cytek®️ Aurora全光谱流式细胞仪建立了迄今最全面的14色小鼠造血系统深度分析方案，更多标记的同时检测得以让研究人员深度对比HSC各亚群的表型重叠程度，从而加深对其功能的理解。Cytek全光谱流式的超多色分析性能赋予了该方案强大的拓展性，研究人员可将此方案作为框架增加更多的Marker，对目标体系进行更深入地解析。