光谱流式血液病应用新进展：一管27色急性髓系白血病微小残留病（AML-MRD）检测方案

背  景

通过多参数流式细胞术 (Multiparametric Flow Cytometry, MFC) 检测急性髓系白血病 (Acute Myeloid Leukemia, AML) 微小残留病变 (Minimal Residual Disease, MRD) ，一直是临床上用于评估疾病复发，预测患者无进展生存期和总生存期的重要手段。由于传统流式细胞仪可用的检测通道数量有限，基于传统流式细胞术发展起来的多参数 AML MRD 方案通常需要分成多个管，研究者很难对所有原始粒细胞的多个参数进行同时测量和相关性评估。光谱流式细胞术的出现，使在单管样本中可同时检测的标记数大大增加， 超过20色的MRD方案成为可能。近日，美国纽约Roswell Park综合癌症中心的研究者，基于Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪，开发了一个单管27色的AML MRD方案，方案纳入了所有推荐的AML检测相关标记。研究者对该方案进行了全面的评估，并将研究成果” Development of a 27‐color Panel for the Detection of Measurable Residual Disease in Patients Diagnosed with Acute Myeloid Leukemia.”发表在Cytometry Part A杂志上。

 

   

研究方法

在充分考虑所有检测靶标的抗原密度、荧光染料强度、表达谱和试剂可用性等因素后，研究者设计了一个27色AML MRD方案，并纳入22例骨髓样本（疑似AML），对方案进行了系列验证。

 

主要验证工作包括：

• 比较单染样本和全染色样本中，每个标记的信号分辨率；

• 比较 27 色方案和传统的 8 色方案，对造血细胞定量分析的准确性；

• 使用梯度稀释实验确定 27 色方案的空白检测限 (Limited of Blank, LOB)、检测限 (Limit of Detection, LOD) 和定量下限 (Lower Limit of Quantification LLOQ)；

• 通过评价操作员内（单个操作员不同操作次数）和不同操作员间的数据变化，以评估方案的可重复性；

• 使用冷冻保存的骨髓细胞，研究了抗体混合物在 120 小时内的稳定性。

 

以上光谱流式细胞术相关的工作是利用Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪（4激光配置）完成的。

         

研究结果

1。利用Cytek提供的各种工具，如Cytek^®️ Full Spectrum Viewer，研究者优化并完成了27色AML MRD方案，最终方案的复杂度指数（Complexity^TM Index）为29.6（图1）。

 

图1-27色AML-MRD方案各染料光谱特征

2.尽管与单一抗体染色的细胞相比，所有抗体的染色指数在完全染色的细胞中略偏低，但所有抗体的阴性信号和阳性信号均得到了清晰的分离（图2）。

 

图2-全染色样本中阴阳性信号仍能清晰区分

3.经过比较，研究者认为，光谱27色方案与传统8色方案之间具有高度一致性，并且27色方案在多个抗体同时检测、避免重复试剂、节省样本等多个方面表现出了明显的优势（表1）。

 

表1-光谱27色与传统8色AML MRD方案的比较

4.梯度稀释实验的数据进一步表明，单管27色分析可轻松实现AML MRD评估所需的0.1%最低检测灵敏度。如表2/图3所示，利用27色方案，研究者能够在0.0045%的频率下准确定量原始细胞，CV为25.79%，低于他们预先定义的和普遍接受的30%的cut-off值（表2/图3）。

 

表2-单管27色方案的检测灵敏度

 

图3-27色AML MRD方案的LLOQ测定

5.重复性实验对比了单个操作员的不同操作次数间，以及不同操作员之间的数据变异性（细胞亚群百分比），除少数情况CV>10%(<20%)，大多数情况下，各细胞亚群计数的CV均可控制在10%以内。因此，研究者认为，使用 27 色方案对细胞亚群的检测具有很好的一致性和可重复性。

6.对27色抗体混合物的稳定性实验显示，抗体混合24小时至120小时后，某些荧光染料的MFI会发生变化（减低/增高），研究者因此提出，应用此27色方案最好是在样品染色前开始制备抗体混合物。（编者注：从研究者展示的数据看，MFI降低比较明显的荧光染料主要是BUV 染料，如果减少或不使用BUV染料，抗体混合物的稳定性可能会有不同的表现。）

 

 

研究结论

研究者基于Cytek^®全光谱流式细胞仪开发了一个单管27色AML MRD方案，并通过严谨细致的系列实验，证实了该27色方案是一个适用于临床AML MRD检测的高灵敏度多参数方案，不仅可增强异常抗原相关性研究，还可以提高对异常分化模式的检测。

随着光谱流式细胞术在临床各个领域的普及，20色以上的多色方案已经逐渐被许多医疗机构开发并用于临床诊疗。无论是从珍贵/有限的样本中获取更多有用的信息，帮助临床医生或研究人员更全面的了解疾病情况，或是节省时间和试剂成本，帮助实验室提高工作效率，基于光谱流式细胞术的多色研究/应用方案无疑将会为临床诊疗/研究工作带来全新的体验。

 

关于本研究27色方案的详细信息和更多验证数据，可进一步参考原文。

 

参考文献：

Soh, Kah Teong, et al. "Development of a 27‐color Panel for the Detection of Measurable Residual Disease in Patients Diagnosed with Acute Myeloid Leukemia." Cytometry Part A (2022).

 

 

关于Cytek

About Cytek /

Cytek Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling™，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器 —— Aurora和Northern Lights™分析系统、Aurora CS分选系统、试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。

更多的相关信息，请登录Cytek的官方网站：www.cytekbio.com和www.cytekbio.com.cn。

注：Cytek^®, Tonbo Biosciences, cFluor^®, Full Spectrum Profiling™, FSP™和Northern Lights™是Cytek Biosciences, Inc. 的商标或注册商标。Cytek^®全光谱检测技术相关专利包括但不限于：US10739245B2，US11169076B2，US10788411B2。

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