细胞外囊泡（EV）研究火热，我们应该怎样测好小颗粒样本？

以光谱流式为代表的新一代流式检测技术，已在细胞样本的超多色分析中取得巨大成功，为科研人员提供了先进的深度免疫表征手段。在细胞分析之外，越来越多的研究人员也希望将流式这种多参数、高通量的单细胞分析技术，应用于如细菌、病毒、纳米药物、细胞外囊泡（EVs）等更小尺寸样本的快速表征。然而，受到仪器灵敏度与实验操作影响，贴近仪器检测极限的小颗粒分析备受挑战。本期推文将结合多篇经典研究论文，介绍流式小颗粒检测实用技巧，并探讨仪器灵敏度提升对亚微米尺度颗粒检测的积极影响。

 

图1. 流式分析常见样本尺寸分布

 

优化实验操作，充分发挥仪器性能

现有装机流式细胞仪中，不同型号的仪器虽然存在灵敏度差异，但普遍具备~200 nm颗粒（PS Beads）检测性能，在仪器状态良好的情况下能够完成细菌、大尺寸EV（~1 μm）等样本的分析。面对贴近仪器检测限的小颗粒样本，合理的实验设计与操作将有助于快速锁定小颗粒信号，提升数据可靠性。

1.阈值设置

无论细胞与小颗粒，散射光信号作为样本固有物理信号始终是阈值设置的首*选通道。相比于常用作细胞阈值的FSC通道（检测限~1 μm），SSC通道（~200 nm）具有更高的灵敏度，因而更适合作为小颗粒阈值/触发通道，并推荐使用对数坐标作图（图2）。当样本颗粒SSC信号无法与背景清晰分离，且样本颗粒均有荧光标记时，也可以借助荧光通道作为阈值¹。上样时，应逐级调高电压，确保小颗粒信号超出背景，并在优化阈值过程中保留部分噪声信号，以清晰展示样本颗粒与背景的信号差异。

 

图2. MLV-sfGFP病毒颗粒检测结果（Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪），阈值通道为SSC

 

2.稀释实验

在EV等尺寸分布较宽的样本检测中，经常遇到样本信号无法与背景基线分离的情况。此时仅通过一张流式散点图无法判定信号来自于单个样本颗粒或过高浓度样本（激光探测区中存在多个颗粒，Swarm Detection）所带来的背景提升。相关样本采集时，常需补充稀释实验加以佐证²。若样本经梯度稀释上样后，信号强度不变、Events Rate与稀释倍数成比例降低，说明信号来自单个颗粒，测试数据可靠（图3）。

 

图3. 通过稀释实验证明信号来自单个样本颗粒

 

3.过滤鞘液与缓冲液

实验室制备的纯水中含有大量200 nm以下杂质颗粒，当目标样本颗粒浓度较低且信号较弱时，杂质颗粒所带来的背景提升将影响数据质量。该问题可以通过使用更小孔径滤芯（如≤0.1 μm）过滤鞘液与样本缓冲液进行改善。

 

紫光侧向散射（V-SSC）提升EV检测分辨率

实验操作的优化能够在一定程度提升数据可靠性，但无法带来检测限的质变。在100 nm的尺度下，同种材质球形颗粒散射信号强度随颗粒尺寸减小呈6次方衰减（瑞利散射定律），该尺度下小颗粒检测性能的提升更依赖于硬件层面的系统更新³。

标准版Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪通过引入紫光侧向散射（V-SSC）检测通道，利用散射光信号随激发波长（λ）的4次方呈反比这一物理性质，并结合高灵敏度创新型全光谱分析检测模块，实现了90 nm聚苯乙*烯微球信号的检测，灵敏度远高于传统流式蓝光SSC通道。我们将以近期利用Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪检测EV的研究工作为例，在回顾精彩数据的同时，讨论小颗粒分析中的常用指标。

1.无标样浓度分析

一项发表于Durg Testing and Analysis的研究工作中，伦敦大学研究人员通过VSSC与CD235a-PE标记建立了红细胞来源EV的浓度表征方法，以评估自体输血后RBC-EV的丰度变化，用于运动员反兴奋剂检测。实验中严格的对照设置帮助研究人员精准确定EV信号位置，仪器绝对计数功能在无标准品加入的情况下快速完成EV浓度分析⁴。

 

图4. RBC-EV浓度表征，合理设置对照帮助准确圈门

 

2.多色分析区分EV来源

弗吉尼亚联邦大学Erdbrügger等人在一项运动健康研究中，通过多色标记对运动后血液中内皮细胞、白细胞、血小板等来源的EV进行了检测，发现一次中等以上强度的运动可降低空腹和胰岛素刺激的中大尺寸EV浓度，并增加代谢性胰岛素敏感性⁵。文章中EV分析数据经MIFlow-EV Checklist验证，以保证数据可靠性⁶。同时，多种来源EV的同时检测也充分证明了Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪超多色分析性能在小颗粒检测中的应用前景。

 

图5. 不同来源EV在Cytek^®️ Aurora全光谱流式细胞仪检测中被清晰分辨

 

3.EV粒径表征

Erdbrügger团队在后续的研究中对上述方案进行改进，利用NIST Traceable微球作为尺寸标准品，通过FCM_PASS Software建立了EV SSC强度与粒径工作曲线（同尺寸下低折射率颗粒具有更小的散射光信号，不同材质颗粒间的粒径-信号强度参数需通过米氏散射理论建立关联）。并将EV尺寸作为检测参数，探究了胰岛素注射与血液中EV丰度的关系。实验发现，中等尺寸EV（200-624 nm）在胰岛素注射后丰度降低，其丰度与代谢灵活性呈负相关。

 

图6. 根据米氏散射建立EV散射信号强度与粒径工作曲线

 

Cytek^®小颗粒增强（ESP）选项，70 nm颗粒也能轻松检测

为进一步拓展光谱流式小颗粒检测性能，Cytek研发团队开发并推出小颗粒检测增强（Enhanced Small Particle，ESP）选项，可以清晰分辨小至70 nm聚苯乙*烯颗粒的散射光信号（图7. A）。前文中所提到的Erdbrügger团队使用搭载ESP选项的Cytek^®️ Aurora全光谱流式细胞仪进一步测试了血液中多种来源EV的粒径分布，并与标准Cytek^®️ Aurora全光谱流式细胞仪检测结果进行对比。数据显示，虽然标准Cytek^®️ Aurora已具备出众的SSC灵敏度，ESP选项的加入依然大幅提升了仪器对100-300 nm EV颗粒粒径分辨能力（图7.C）。

 

图7. ESP选项将Cytek^®️ Aurora全光谱流式细胞仪散射光检测限刷新至70 nm

 

结 语

众多经典案例表明，在小颗粒样本的流式分析中，科学的实验设计与仪器灵敏的检测性能必不可少，Cytek^® ESP选项的推出无疑刷新了全光谱流式散射光检测极限，使Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪及Cytek^® Northern Lights^TM全光谱流式全面满足小至EV、病毒大至细胞等不同尺度样本的高灵敏检测需求。更多小颗粒样本检测技巧欢迎阅读参考文献。

 

参考文献：

1.Nolan J P, Stoner S A. A trigger channel threshold artifact in nanoparticle analysis[J]. Cytometry Part A, 2013, 83(3): 301-305.

2.Nolan J P. Flow cytometry of extracellular vesicles: potential, pitfalls, and prospects[J]. Current protocols in cytometry, 2015, 73(1): 13.14. 1-13.14. 16.

3.Zhu S B, Wang S, Yang L L, et al. Progress in the development of techniques based on light scattering for single nanoparticle detection[J]. Science China Chemistry, 2011, 54(8): 1244-1253.

4.Voss S C, Yassin M, Grivel J C, et al. Red blood cell derived extracellular vesicles during the process of autologous blood doping[J]. Drug Testing and Analysis, 2021.

5.Heiston E M, Ballantyne A, La Salvia S, et al. Acute exercise decreases insulin‐stimulated extracellular vesicles in conjunction with augmentation index in adults with obesity[J]. The Journal of Physiology.

6.Welsh J A, Van Der Pol E, Arkesteijn G J A, et al. MIFlowCyt‐EV: A framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments[J]. Journal of extracellular vesicles, 2020, 9(1): 1713526.

7.Heiston E M, Ballantyne A, Stewart N R, et al. Insulin Infusion Decreases Medium-Sized Extracellular Vesicles in Adults with Metabolic Syndrome[J]. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 2022.

 

 

关于Cytek

About Cytek /

Cytek Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球技术生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling™，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器 —— Aurora和Northern Lights™分析系统、Aurora CS分选系统、试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。

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