免疫“作战”区域一览无余！Amnis®成像流式系统—检测免疫突触的利器

研究背景

靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）T细胞在治疗B急性淋巴细胞白血病（BL-ALL）中展现出显著疗效，但高达39%的患者会因CD19阴性复发而导致治疗失败。基于此，研究者在单个T细胞上共表达靶向CD19、CD20和CD22的CAR分子，成功构建出CD19/20/22CAR T细胞，将CD19CAR T细胞的靶向范围拓展至CD20和CD22，使其既能清除CD19阴性逃逸的BL-ALL细胞，又能保留对CD19阳性疾病的前线疗效。

检测CAR T细胞与肿瘤细胞形成的免疫突触：

实验发现CD19/20/22CAR T细胞在体外表现出更优的杀伤肿瘤细胞的活性，这是否与单个T细胞水平上更高效的肿瘤相互作用动力学相关呢？研究者进一步使用Amnis®成像流式细胞仪检测CAR-T细胞与肿瘤细胞间形成的CAR免疫突触（CARIS；图2）。

图2：嵌合抗原受体免疫突触（CARIS）的面积和张力示意图

将UPN03细胞（病人来源的BL-ALL）与未修饰T细胞（NT）、CD19CAR T细胞或CD19/20/22CAR T细胞按1:1比例共培养1小时。孵育后，使用Amnis®成像流式细胞仪检测CD3（BV450）、鬼笔环肽（FITC，用于标记F-肌动蛋白）及7-AAD（细胞活力染料）的表达。

利用IDEAS™软件对免疫突触进行分析：

实验聚焦于T细胞（CD19/20/22CAR、CD19CAR或未修饰T细胞/NT）与BL-ALL细胞的双联体（图3），分析的第一步是找出双联体细胞，首先利用7-AAD标记的DNA含量及细胞形态的纵横比（Aspect Ratio）画图，纵横比接近于1则证明该事件为单个细胞，纵横比接近于0.5则说明该事件为双联体，再加上图像信息的辅助确认，可在图中区分出单细胞和双联体。随后筛选出同时包含T细胞（CD3标记）与BL-ALL（利用CD3阴性信号区域及其细胞面积判定）的双联体进行后续分析。

图3：使用Amnis®成像流式系统的IDEAS™分析软件对免疫突触进行分析

根据双联体中两个DNA簇之间的长度与面积来进一步定义出免疫突触。图3中的最后一张图展示了免疫突触的典型特征：DNA被标记为红色，而F-肌动蛋白显示为绿色。白色框中圈起来的免疫突触的区域可被Amnis®成像流式系统进一步量化和分析（图3），可量化CARIS的有效面积（CARIS^area）、肌动蛋白微簇密度（CARIS^density），以及效应细胞和靶细胞的核间距离，用于评估CARIS的张力（CARIS^tension，图2）。

实验结果（本文仅介绍成像流式部分）：

通过定量统计分析CARIS发现：与CD19CAR或NT T细胞相比，CD19/20/22CAR T细胞与BL-ALL细胞形成的CARIS的面积大小无明显差异（图4C）。但是，CD19/20/22CAR T细胞的CARIS^density显著高于CD19CAR或NT T细胞（图4D）。并且，CD19/20/22CAR T细胞与靶细胞的核间距离显著比其他两种细胞的更短（图4E），提示其有更高的CARIS^tension。观察到的CARIS特性差异表明，CD19/20/22CAR T细胞相比于CD19CAR T细胞具有更优的CARIS细胞骨架特性，从而在结合BL-ALL细胞时展现更强的免疫活性。

图4：量化分析：(C) CARIS的面积（CARIS^area）；(D) CARIS中F-肌动蛋白（鬼笔环肽标记）的荧光强度（CARIS^density）；(E) T细胞与BL-ALL之间鬼笔环肽强度的比值（CARIS^tension）。