Big Panel Theory系列之—23色光谱流式方案全面解析胎盘MSC异质性

间充质基质细胞(Mesenchymal Stromal Cell, MSC)是一种异质细胞群，可从如骨髓、脂肪、脐带、胎盘等组织中分离提取，具有强大的分泌、免疫调节及归巢特性，在心肌梗塞、炎症性肠病、青光眼、骨关节炎等多种疾病中具有潜在应用价值。体外培养的MSC细胞通常依据国际细胞治疗学会（ISCT）推荐的最低表型标准（即表达CD73, CD90和CD105的，不表达CD31, CD34, CD45, HLA-DR等造血和内皮标志物）进行区分。然而，已有研究表明，MSC在体外培养条件下的表型变化可能掩盖其潜在功能与异质性，体外培养前的MSC表型分析将提供更丰富的功能信息。为此，奥克兰大学Anna Boss团队利用Cytek^® Aurora（3激光）全光谱流式细胞仪开发了23色高维分析方案，发现了4种异质性胎盘间充质基质细胞（pMSC）亚群，并利用该方案的简化方案（15色）评估了培养pMSC的细胞来源，以及体外培养对其表型的影响。

图1. MSC细胞具有强大的分泌、免疫调节功能

 

 

 

方案设计

23色pMSC高维分析方案抗体列表如图2所示，分别包含经典文献中滋养层细胞、造血干细胞、内皮细胞、间充质细胞、成纤维细胞及祖细胞标志物。方案配色借助Cytek^® Full Spectrum Viewer完成。23色方案（图2，Panel 1）用于发现pMSC异质性群体，15色简化方案（图2，Panel 2）用于评估pMSC经体外培养后的表型变化。

 

图2. pMSC高维分析方案抗体列表，Panel 1为23色方案，Panel 2为15色简化方案

 

样本制备流程如图3所示，胎盘外植体样本由胎盘绒毛组织中分离，经酶解、过滤、裂红步骤获取单细胞悬液后进行染色与流式检测。抗体滴定与FMO对照被用于方案优化，以确定最佳抗体用量及区分阳性群体。

 

图3. 胎盘绒毛核心细胞单细胞悬液制备流程

 

pMSC异质性分析

妊娠前三个月胎盘绒毛核心细胞样本23色光谱流式检测结果如图4所示，数据经排除碎片、黏连体、死细胞、滋养层细胞（ITCβ4+）、造血细胞（CD45+CD235a+）干扰后由viSNE降维展示（图4）。结合已知的细胞类群标志物表达图谱，可从viSNE降维数据中区分CD31+CD34+内皮细胞（类群1）以及4种异质性的MSC亚群（CD73+CD90+间充质细胞，类群2；CD146+CD271+血管周细胞，类群3；Podoplanin+CD36+细胞，类群4；CD26+CD90+肌成纤维样细胞，类群5）。其中，类群3-5与前期研究中的单细胞RNA测序结果一致，而类群2因其在妊娠9周后极低的丰度未能被单细胞RNA测序检出，低丰度细胞群体的发现凸显出光谱流式高通量高维分析性能优势。

 

图4. 23色光谱流式检测方案揭示pMSC异质性

 

pMSC表型差异预示其功能多样性

为了探索各亚群在胎盘绒毛中的功能，研究人员对各亚群表型与功能进行了更深入的分析。例如，类群2是唯/一共表达CD73+CD90+的绒毛细胞类群，该类群还表达细胞迁移相关标志物Podoplanin，低表达凝血相关标志物CD142，且异质性表达血管周细胞标志物CD271、CD146，表明此类群可能是一种功能分化的类群，在早期妊娠中促进造血迁移和分化等；类群4由Podoplanin、CD36的表达确定，共表达CD26、CD90、CD142，由于该类群丰度最高，且表达增殖/迁移相关标志物（CD26/Podoplanin）（图5），研究人员推测该类群最有可能为体外培养后pMSC的主要来源。

 

图5. 绒毛核心亚群表型特征分析

 

体外培养pMSC表型评估

研究人员使用光谱流式15色简化方案（图2，Panel2）对体外培养MSC细胞进行检测，分析了体外培养MSC与原位状态下的表型差异。Pannel1中确认的CD73+CD90+细胞(类群2)、podoplanin+CD36+细胞(类群4)经分选后与外植体pMSC细胞在相同条件下培养7天，并进行光谱流式检测。检测结果（图6）表明，培养后的细胞发生表型收敛，表现出MSC细胞的特有表型（CD90+CD73+CD142+CD271-CD36-），但仍保留能够体现其来源的表型特征；外植体pMSC细胞经培养后，表型异质性降低，且与类群4细胞分选培养后的表型最为相似，进一步证明该类群为培养后pMSC细胞的主要来源。

 

图6. 类群2、4级外植体pMSC细胞经培养后的表性分析结果（Panel2）

 

   

总 结

本研究中，Anna Boss团队使用3激光Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪搭建并优化了23色pMSC分析方案（已发表文献中最多色MSC流式检测方案），深度揭示了pMSC表型异质性以及经培养后的表型变化。该方案的搭建为MSC质控、培养条件优化等方面提供了宝贵的资源，更多方案细节，欢迎阅读文献原文。

参考文献：

Boss A L, Damani T, Wickman T J, et al. Full spectrum flow cytometry reveals mesenchymal heterogeneity in first trimester placentae and phenotypic convergence in culture, providing insight into the origins of placental mesenchymal stromal cells[J]. Elife, 2022, 11: e76622.

 

 

关于Cytek

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