Big Panel Theory系列之—5激光24色大鼠组织损伤免疫分析方案

究人员提供更丰富的实验信息。然而，由于小鼠模型在基础免疫学研究中占据优势，针对大鼠的商业化流式抗体相对缺乏，这无形为大鼠高维免疫分析方案的开发增加了难度。近期，美国NIH研究人员充分利用Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪相似染料分辨与自发荧光提取功能，开发了大鼠24色表型分析方案，用于揭示体积性肌肉损伤（VML）中独特的免疫特征。

   

 

图1. 24色大鼠VML分析方案分析方案门控策略

 

 

方案设计与优化

24色大鼠VML分析方案门控策略与标志物选择如图1所示，方案中使用了多种大鼠模型中未被广泛使用的标志物，以精细识别T、B及髓系细胞亚群，并分析其激活与极化状态。例如该方案中通过CD86、CD163区分M1、M2型巨噬细胞；利用CD1d识别可递呈脂质及非蛋白抗原的免疫细胞；借助细胞因子受体（CCR1、CCR4、CCR5、CCR8）进一步细分Th细胞类群。    

图2. 24色大鼠VML分析方案抗体列表

 

 

 

考虑到大鼠商业化流式抗体的品类限制，研究人员在搭建方案时优先选定了染料选择受限的荧光抗体，并在后续方案搭建中兼顾强弱搭配原则以及共表达标志物间的荧光泄露（抗体列表如图2所示）。此外，该研究还使用Cytek^®光谱查看器中的相似指数/复杂指数对方案可行性进行评估（图3）。方案中复杂指数为9.42，最高相似指数为82%（BV421/V450），低于Cytek^®光谱流式细胞仪可区分的98%。

   

图3. 通过相似指数及复杂指数评估染色方案可行性

 

 

 

样本染色及检测过程中，该研究通过LIVE/DEAD染料-细胞因子受体-TCRγδ-其余染料的染色顺序分步染色，以最大化弱表达标志物染色效率。此外，考虑到组织损伤样本中含有大量髓系细胞，其自发荧光光谱特征多样且信号较强，研究人员利用V7-UV7通道散点图识别了样本中3种自发荧光组分，并将其录入参考光谱库，用于排除自发荧光干扰。

拓展阅读：多重自发荧光提取，Cytek带你深度解析炎症组织中的髓系细胞

 

 

 

   

图4. 多重自发荧光提取功能排除自发荧光干扰

 

 

 

数据表现

组织损伤样本流式检测结果如图5所示，数据分析中研究人员通过FMO Control区分标志物阳性表达，并将手动圈门结果叠加至tSNE/UMAP图中进行展示。即便损伤组织样本相比于淋巴器官具有更高的复杂性，24色光谱流式方案仍展现出优异的数据质量。    

图5. 组织损伤光谱流式分析方案手动/降维分析结果

 

 

 

细胞丰度分析结果（图6）显示，组织损伤样本中存在大量的巨噬细胞（组织损伤主要效应细胞），且更多表现为CD163+M2细胞。此外，Treg-like（CD25+）与Th2-like（CCR4/CCR8+）T细胞比例高于Th1-like（CCR1/CCR5+）细胞，该两种细胞群体与组织损伤/再生的关联已被多项研究证实。

 

 

图6. 组织损伤样本主要细胞类群丰度对比

 

 

 

总  结

该研究工作通过严谨的实验设计与优化，在商品化荧光抗体选择性受限的背景下成功搭建了大鼠24色深度免疫分析方案。虽然该方案针对VML免疫反应而开发，但广泛的标志物选择使该方案具有较强普适性。例如方案中可检测的巨噬细胞（M1/M2）在抗肿瘤/促肿瘤中发挥重要作用；γδT细胞与肿瘤、感染及自身免疫性疾病相关。这意味着该方案同样适用于其他大鼠临床模型的免疫分析。

参考文献：

Adusei K M, Ngo T B, Alfonso A L, et al. Development of a high-color flow cytometry panel for immunologic analysis of tissue injury and reconstruction in a rat model[J]. Cells Tissues Organs, 2022: 1-12.

 

 

 

 

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