免疫细胞表征是提升我们对免疫学理解的非常重要的手段之一，其中，同时分析同一细胞的细胞表型和抗原特异性功能反应是很有价值的，一方面可以实现更全面的免疫细胞行为解读，另一方面也可最大限度地从珍贵的样本中获得尽可能多的信息。

流式细胞术是免疫细胞表征非常重要的工具。早期的检测受方案大小的局限，要么集中检测免疫表型，要么仅专注于功能检测。近年来，随着全光谱流式细胞术的发展，超过30多个标记的方案变得容易，更高级的综合分析成为可能。

 

来自荷兰莱顿大学医学中心传染病的研究小组，基于Cytek^® 全光谱流式系统，开发了32色人PBMC拓展分型方案，覆盖细胞表面标志物、趋化因子受体、MHC-肽四聚体和细胞内细胞因子等检测标记。该方案能够对细胞表型和评估免疫反应质量的标记进行综合分析，有助于对免疫系统理解的提升。

 

研究方法

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32色方案包括23个主要细胞亚群的表型标记，以及9个评估HLA-E特异性T细胞相互作用和细胞因子产生的标记（表1）。方案优化所涉及的如抗体滴定、参比对照优化、自发荧光校正以及添加Brilliant Stain染料缓冲液和True-Stain单核细胞阻断剂等操作，均参考OMIP-069进行。

 

表1-32色方案中包含的标记及意义

 

染色好的样本在Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪上获取，获取数据用FlowJo v10.8.0和OMIQ分析软件（www.omiq.ai）进行分析。研究者推荐的染色流程如下图1所示（图1）。

 

图1 - 检测趋化因子受体、四聚体和细胞内细胞因子的

最佳工作流程

 

研究结果

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1. 关于趋化因子、四聚体和胞内因子染色

趋化因子：测试4℃ vs 37℃下趋化因子受体的染色效果，发现在37°C下，对趋化因子受体CCR2、CCR4、CCR6、CCR7和CXCR3进行染色可改善信号，表现为阳性信号的灵敏度和分离度得到提高；而CX3CR1表达水平受温度影响有限（图2A）。

 

四聚体：图2B上行所示为染色顺序对四聚体（TM）染色性能的影响，当CCR和TM一起孵育（CCRs+TM），或TM染色后进行CCR染色（1TM, 2CCRs），与仅TM染色相比（TM only），TM信号明显丢失；先对CCR进行染色，然后进行TM染色（1CCRS, 2TM），与最佳的“仅TM”信号相比，检测灵敏度相似。图2B下行所示为染色顺序对CCR4染色性能的影响，与仅CCR染色相比（CCR only），在TM染色后CCR染色时（1TM, 2CCRs），观察到总CCR4群体的变化，而在TM染色之前进行CCR染色时（1CCRS, 2TM）未观察到。在TM染色之前进行CCR染色时，其他CCR也观察到与类似的表现（图2C），趋化因子受体或四聚体的信号没有丢失，因此，将其（1CCRS, 2TM）确定为最佳染色顺序。

 

图2 - 测试趋化因子受体、四聚体和细胞因子的染色条件和组合

 

胞内细胞因子：将细胞内IFN-γ和TNF-α染色与TM染色相结合（TM+ICS），并将这些标志物的性能与仅使用TM（TM only）或仅细胞内细胞因子检测染色（ICS only）进行比较（图2D）。四聚体阳性细胞的比例在TM only（0.41%）和TM+ICS时（0.40%）保持不变（图2D上行）。对于测试的两种细胞因子，与不使用TM染色相比，在细胞内染色之前进行四聚体染色时，没有观察到信号或细胞比例损失。说明，高或低比例的细胞因子，在与低比例四聚体阳性细胞组合的情况下，均可被检测到，且无论是胞内细胞因子还是TM，其染色性能均不受共染色的影响。

2. 32色方案的性能表现

手动设门和无监督聚类分析的数据分别显示于图3和图4。在排除不规则事件、双细胞和死细胞后，按设门逻辑依次区分出单核细胞（经典、非经典和中间）和淋巴细胞，后者根据表达标记进一步进行类别和功能亚群细分，设门逻辑和详细分群情况可参考原文。（图3）

 

图3 - 32色方案手动设门策略

 

通过UMAP降维和FlowSOM无监督聚类方法，使用OMIQ软件可视化所有主要细胞亚群，主要分为CD4+ 细胞（细胞簇1-8） ，CD8+ 细胞（细胞簇9-15）， TCRγδ+ T细胞 （细胞簇16）， NK 细胞（细胞簇17），B细胞（细胞簇18-19），及单核细胞（细胞簇20-23）。图4C在聚类热图中展示了这些主要细胞亚群的标记表达情况。（图4）

 

图4-通过UMAP和FlowSOM进行的高维数据分析

 

结 论

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荷兰研究者开发的32色人PBMC拓展分型方案，包括细胞表面标记，趋化因子受体，以及功能相关的四聚体和细胞因子标记。允许在同一个样本中，进行主要细胞亚群的识别，并同时鉴定抗原特异性和细胞因子。研究者认为，对于免疫细胞库的研究，这样的方案是非常实用的，将有助于扩大我们对疾病状态、治疗效果或疫苗诱导反应的理解。

参考文献：

van Wolfswinkel, Marjolein, et al. "Extensive flow cytometric immunophenotyping of human PBMC incorporating detection of chemokine receptors, cytokines and tetramers." Cytometry Part A (2023).