细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为蛋白质、mRNA、miRNA、脂质等信息物质在细胞间转运的载体, 是细胞与细胞间通讯的重要媒介，参与大量正常生理和病理过程，包括感染性疾病、自身免疫性疾病、心血管和其他炎症性疾病、癌症和凝血障碍等，因此研究EV在人类健康和疾病中的作用具有重要意义。

 

EVs常分为三类

• 外泌体 (30-150 nm) ，在胞体内区室中形成多囊泡小体，随后与质膜融合后从细胞中释放。

• 微囊泡或微粒 (100-1000 nm) ，这是质膜起泡/出芽以及随后从细胞中释放的结果。

• 凋亡小体 (1000-5000 nm) ，由凋亡细胞释放。

   

目前还没有特异性标记物可以最终鉴定不同类型的囊泡。因此，我们把这些小的生物颗粒统称为细胞外囊泡。

 

细胞外囊泡示意图

  

EVs检测

研究表明，不同疾病状态下，组织器官释放到体液中的EVs的数量及所包裹的物质是完全不一样的，因而通过检测分析EVs的特性即可对相关疾病进行精准诊断、预后判断及指导治疗。EVs具有尺寸小、异质性高且数量巨大等特点，一直以来，检测灵敏度都是EVs研究中的一个重大挑战。虽然一些关于EVs的检测是利用传统流式细胞术开展的，但也暴露出了明显的局限性，一方面由于传统流式仪器更适用于检测细胞，而细胞表面结合的荧光分子数量远远多于EVs表面；另一方面，一些传统流式仪器在检测小于500 nm单个颗粒上表现吃力。因此，想要准确的检测EVs，就需要更强大且具备高通量功能的检测工具。

  

Amnis^® 成像流式的技术优势

近年来，随着Amnis^®成像流式技术的发展，越来越多的研究利用这项技术解决了EVs检测这一难题。Amnis^®技术的核心是使用时间延迟积分CCD (TDI-CCD)进行信号检测。与光电倍增管(PMT)相比，CCD具有更大的动态范围、更低的“噪声”和更高的量子效率，使其更适合测量微弱信号。与传统流式细胞术相比，这种方法信号整合时间更长，噪音低，灵敏度大幅增加，对研究EVs具有独特的优势。

  

Amnis^®技术EVs应用案例分享

以下研究体现了Amnis^® 成像流式技术在小颗粒检测中的高灵敏度特点。

 

 

检测脂质体和微球流式技术对比

用常规流式技术 (A-B)和成像流式技术 (C-D)获得的200 nm大小的荧光标记脂质体和不同尺寸的聚苯乙/烯珠(220、450、880和1300 nm)。Amnis®成像流式可以清晰地分辨出缓冲液背景信号(灰色)以上的所有脂质体(粉色)，而常规流式仅能通过荧光分辨出一小部分脂质体。

 

 

健康人类供体的血浆微粒检测

(a)从6名健康供体中获取无血小板血浆，并使用CD235(红细胞)、CD41(血小板)、CD45(白细胞)和CD146(内皮细胞)标记物进行染色以确定微粒细胞的来源。

(b)利用CD14(单核细胞)、CD66b(中性粒细胞)和CD3(淋巴细胞)标记物进一步对白细胞微粒进行表型分析，以确定其来源细胞。下方是图库中事件的代表性图片。

(c)表为N = 6例供体的绝对计数±SEM。

 

如图所示，Amnis^®成像流式技术可实现不同来源的外泌体的精准鉴定与计数。

 

 

 

单核细胞内化外泌体检测

(a)用Amnis^®成像流式技术分析PKH67标记的外泌体。BF和FITC荧光图像(E)所示。

(b) PKH67预标记外泌体与外周血单个核细胞共孵育。使用Amnis^®IDEAS^®软件内化功能测量外泌体的内化程度。

 

Amnis^®成像流式技术不仅实现了PKH67标记的外泌体鉴定，同时也实现了单个核细胞内化外泌体检测，且呈现直观图像佐证结果准确性。

  

小结

综上，Amnis^®成像流式技术做到了真正意义上的流式数据可视化。既具备传统流式可大量检测样本的特点，又利用高灵敏度TDI-CCD技术针对每个检测到的外泌体颗粒进行成像，并可通过海量形态学数据分析EVs与亲本细胞或靶细胞间的相互作用。

 

 

 

Cytek^® Amnis^® ImageStream^®x Mk II 

成像流式细胞分析仪

以上研究均通过Cytek® Amnis® ImageStream®X Mk II仪器完成。

通过将流式细胞术的表型分析能力、高速度和高灵敏度等优势，与荧光显微镜技术在细胞形态学细节的洞察力和针对细胞功能研究的深度有机结合在一起，Amnis^® ImageStream^®XMk II 平台可高速获取每个细胞的多个图像，包括明场、暗场 (SSC) 和多达 10 色荧光标记。ImageStream^®X Mk II 通过高分辨率成像，可以定位荧光蛋白表达位置（细胞膜、细胞质或者细胞核），实现超乎想象的广泛应用需求。

 

 

技术特点

应用广泛：样本利用率高达 95%，可以更高效的方式分析稀有细胞。

简单易用：简单友好的用户界面，可实时观察全部细胞图像和统计学数据。

配置灵活：最高可升级至 6 根激光器。

功能强大：提供数百种量化成像分析参数，实现无/与伦比的广泛应用。

 

参考文献：

Erdbrügger, Uta, and Joanne Lannigan. "Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques." Cytometry Part A 89.2 (2016): 123-134.

Headland, S., Jones, H., D'Sa, A. et al. Cutting-Edge Analysis of Extracellular Microparticles using ImageStreamX Imaging Flow Cytometry. Sci Rep 4, 5237 (2014). https://doi.org/10.1038/srep05237.

Clark, R. Imaging flow cytometry enhances particle detection sensitivity for extracellular vesicle analysis. Nat Methods 12, i–ii (2015). https://doi.org/10.1038/nmeth.f.380.

Gurunathan, S.; Kang, M.-H.; Jeyaraj, M.; Qasim, M.; Kim, J.-H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells 2019, 8, 307. https://doi.org/10.3390/cells8040307.