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慢性乙肝病毒感染是全球公共卫生面临的重大威胁之一，尽管干扰素应用在临床治疗中成效显著，但是，对其作用机制的深入探索，一直止步于缺少合适的体内实验评价模型。广州医科大学附属市八医院李锋/唐小平团队2023年11月发表于Nature communications的成果，填补了这项研究的空白。基于CRISPR/Cas9技术构建I型干扰素受体人源化小鼠模型（huIFNAR），重现了干扰素治疗慢性乙肝时，抑制肝内病毒复制和实现HBsAg血清学转化的过程，为慢性乙肝的临床诊疗提供了有力的平台支撑。

 

 

研究背景

慢性乙肝病毒感染是全球公共卫生问题，乙肝患者发展到肝硬化和肝癌的风险很高。干扰素治疗策略对于慢性乙肝患者，尤其是儿童和HBsAg低水平患者的疗效显著。在乙肝病毒靶向药物和治疗性疫苗临床研究中，联合干扰素治疗能够有效促进HBV功能性治愈（功能性治愈的定义：停药后血清中HBsAg和HBV DNA长期检测不到）。在体外细胞模型中，诸多文章已经证明干扰素通路能够下调HBV病毒复制，并且，各类干扰素刺激基因参与到抑制病毒生命周期的各个环节当中。然而，干扰素在体内的作用机制由于实验模型的匮乏，目前尚不明确。由于干扰素家族的多样性和受体的特异性，限制了人源干扰素在野生型小鼠中的应用。研究人员巧妙地将人源I型干扰素受体构建到小鼠模型上，成功地将该模型应用于评估人源IFNα刺激下，小鼠基因表达谱和免疫细胞亚群的改变。

 

结果赏析

 

构建I型人源干扰素受体小鼠模型

 

为了更真实地模拟人源干扰素作用于HBV感染的宿主后，引起的机体免疫微环境变化，研究人员基于CRISPR/Cas9敲入技术设计了串联表达盒，将人源IFNAR2和IFNAR1基因插入到小鼠IFNAR2基因的2号外显子区域。从huIFNAR模式图上看到，人源受体表达于胞外，可以特异性结合人源IFNα，刺激胞内鼠源部分的基因表达，进而激活下游通路。体外和体内实验均证明人源IFNα2作用下，能够成功激活huIFNAR小鼠免疫反应。

 

构建huIFNAR小鼠模型和功能性评估

人源PEG-IFNα2抑制huIFNAR小鼠体内HBsAg表达水平

 

PEG-IFNα2刺激huIFNAR小鼠PBMC之后，可以获得跟人PBMC相似的免疫反应，证明了huIFNAR小鼠模型能够应用于人源I型干扰素体内功能性评估。基于该模型，第一次真实的模拟出人源IFNα2刺激后机体组织特异性免疫反应，全面绘制出小鼠体内大脑、外周血、肺、心、肝、脾、肾、肌肉和小肠9种组织的基因表达谱。研究人员又进一步评估了PEG-IFNα2对于AAV-HBV慢性感染huIFNAR小鼠的调控作用，与干扰素处理C57BL/6J野生型小鼠和PBS处理huIFNAR小鼠对照组相比，干扰素处理huIFNAR小鼠15周后，HBsAg和HBeAg的表达水平呈现显著性降低。

 

人源PEG-IFNα2抑制AAV-HBV在huIFNAR小鼠模型的慢性感染

人源PEG-IFNα2处理15周后小鼠肝内免疫细胞的变化追踪

 

人源PEG-IFNα2处理huIFNAR小鼠后，研究人员对其实验终点的小鼠肝脏免疫微环境进行评估。首先基于单细胞测序平台筛选到有显著性差异的细胞亚群，再利用全光谱流式进行功能性验证，结果显示MHCII+Ly6C+单核细胞、促炎巨噬细胞和CD8+TEM数量增加，其中CD8+TEM和总的CD8+T细胞的PD-1表达丰度也升高。CD8+T细胞上耗竭指标的表达，提示了可能体内免疫细胞抑制HBV感染的能力在下降，免疫检查点抑制剂与干扰素“双管齐下”的免疫疗法可能成为未来优化治疗策略的方向。

 

全光谱流式评估肝内单核、巨噬

和CD8+T细胞表达水平

 

总结展望

 

研究人员成功构建了huIFNAR小鼠模型，真实地模拟了人源干扰素刺激机体后，9种组织特异的转录组表达谱变化。长时间的干扰素处理huIFNAR小鼠后，观察到HBsAg水平显著性下降甚至实现血清学转化，揭示了huIFNAR小鼠模型在HBV药物筛选研发和疫苗开发领域的应用价值。文章中肝内免疫细胞的精细分群和功能性评估借助了3激光Cytek® NL-CLC全光谱流式平台，设计1管20色的方案，花费更少的样本，获得更丰富全面的信息。

 

3激光20色小鼠全光谱流式方案

 

 

Cytek®NL-CLC系统最高可配置3激光41个检测通道，是首/款获得临床医疗器械注册证的全光谱流式细胞仪，革新性的技术为临床实验室、制药公司、科研机构等客户带来全新体验，可以满足各种流式临床及科研应用的需求。

 

Cytek^®NL-CLC全光谱流式细胞仪

 

 

参考文献

Wang, Y. et al. Interferon stimulated immune profile changes in a humanized mouse model of HBV infection. Nat Commun 14, 7393, doi:10.1038/s41467-023-43078-5 (2023).