- 移动端
Cytek Biosciences品牌商
6 年
手机商铺
- NaN
- 0
- 1
- 2
- 1
推荐产品
公司新闻/正文
Cytek® Guava® easyCyte™流式细胞仪-药物筛选的高性价比选择
436 人阅读发布时间：2024-12-17 10:33
背景
在药物筛选、苗头化合物的识别以及评估药物作用模式时，需要同时了解药物如何调节最终导致细胞毒性，破坏或改变细胞增殖的关键细胞参数和活动。这在肿瘤研究中尤为重要，因为在该研究中，使用混合药物的组合策略可以对细胞的增殖和凋亡产生附加/协同效应。
流式细胞术可对细胞群之间进行精准的量化比较，并能统计大量的样本，这显著增强了剂量反应的计算，因此成为药物和毒素筛选过程中强有力的工具。
摘要
本文使用了微毛细管式的流式细胞仪easyCyte™ 12HT系统以及InCyte™软件进行药物筛选和实验分析。基于96孔板筛选，对毒性化合物进行筛选并识别出关键的苗头化合物。如图1所示，主要进行了两个实验：
1）细胞毒性实验：同时检测线粒体膜电位的变化、基于annexin V的细胞凋亡、caspase 3/7的激活以及细胞死亡情况；
2）评估细胞基于Ki67的增殖反应。
图1：实验流程图
实验方法
将包含细胞毒素、免疫抑制剂、抗增殖剂和抗炎化合物在内的80个化合物以10μM或40 μM的浓度加入到在96孔板中的Jurkat细胞中，并设置阴性对照（加入0.2% DMSO）和阳性对照（用1 μM蛋白酶抑制剂星孢菌素处理）。
南蛇藤醇（celastrol）是一种已知的抗氧化剂和抗炎化合物；藤黄酸（gambogic acid）是抗肿瘤的化合物；硫汞撒（thimerosal）是一种抗菌和防腐的化合物。在剂量-反应实验中，细胞被0.08-10 μM的 celastrol处理24小时；在时间-反应实验中，细胞被10 μM gambogic acid或2.5 μM thimerosal分别处理0,3,6,16,24个小时。
使用MitoSense Red dye对线粒体膜电位进行检测，用Annexin V-BV421以及Caspase 3/7-FAM检测细胞凋亡情况，用7-AAD检测细胞死活。此外，使用Ki-67-PE监控细胞增殖的情况。
化合物对细胞作用的验证
从图2可以看到，使用gambogic acid处理Jurkat细胞后发现，细胞的膜电位下降，caspase的活性增强，annexin V阳性细胞增强并且死亡细胞增多。结合多个细胞健康的表面标记物分析可了解到细胞凋亡的具体通路，正如图2中所展示的，并不是所有annexin V阳性的细胞都是caspase 3/7阳性的。
图2: 细胞健康检测：（A）对照组Jurkat细胞，（B）用gambogic acid处理16小时候的Jurkat细胞
Jurkat细胞被2.5 μM的抗炎化合物celastrol处理后，与对照组相比，细胞的Ki67表达下降，说明化合物处理后细胞增殖能力下降（图3）。Celastrol已被证明是通过下调细胞周期蛋白D和E3的表达，来抑制肿瘤细胞的增殖。
图3：Ki67检测细胞增殖: （A）对照组Jurkat细胞，（B）用celastrol处理过的Jurkat细胞
实验结果
1、筛选实验
用80个细胞毒性化合物库处理Jurkat细胞后，检测细胞健康状况。easycyte InCyte™软件中的热图功能可同时展示和比较四个通道（线粒体膜电位，annexin V, caspase 3/7，7-AAD）的差异，可直观展示数据分析的结果，快速识别苗头化合物。如图4中所展示，虽然使用10 μM （图4A）和40 μM（图4B）化合物处理细胞后的结果是类似的，但是从每个苗头化合物所显示的饼图蓝色的深度可以看出，用40 μM浓度化合物处理细胞后，相比10 μM化合物处理的结果，对细胞有更高比例的细胞健康上的影响。
图4：InCyte™软件热图展示化合物处理后细胞健康情况。（A）左边96孔板是使用10 μM浓度的化合物库处理的Jurkat细胞；（B）右边96孔板是使用40 μM浓度的化合物库处理的Jurkat细胞。
2、筛选后对细胞有显著影响的化合物
从图4所示的80种化合物中，我们排除自荧光化合物以及引起的变化不到20%的化合物，我们将重点关注在任一浓度下都显示对细胞健康情况有影响的化合物上。如图5所示，20种化合物可在10 μM的化合物库浓度下诱导细胞反应，而在40 μM的浓度下诱导细胞反应的化合物数量则在此基础上增加了1个。并且可从图中直观看出，不同化合物以及化合物的不同浓度对于细胞的作用都是有明显差异的。
图5：浓度分别为10 μM和40 μM时，对Jurkat细胞有显著影响的化合物总结
3、剂量-反应分析
从上述筛选结果中，选择了一部分化合物进行进一步的剂量和时间反应分析。以celastrol为例做分析，被不同细胞健康标记物标记的细胞群在不同浓度下的比例被展示在图6中。结果显示：线粒体膜电位的丢失与annexin V染色的结果类似，并且在一定浓度范围内，有更低比例的细胞表现出caspase的活性。并在超过一定浓度后，Ki67阳性细胞比例下降，证明细胞增殖减少。这个实验证明了与引起细胞死亡的浓度相比，用较低浓度化合物celastrol处理后的细胞会造成线粒体的去极化，凋亡以及细胞增殖的减少。
图6：Jurkat细胞对celastrol的剂量反应
4、时间-反应分析
用抗肿瘤化合物gambogic acid和防腐抗菌化合物thimerosal处理Jurkat细胞不同时间。gambogic acid处理后的结果展示了细胞线粒体和凋亡随着时间增加的反应，与其他细胞健康的表面标记物相比，在gambogic acid处理后，即使在很早的时间点，细胞就出现了程度较大且明显的线粒体膜电位的丢失。Annexin V和caspase 3/7阳性细胞群的比例随着处理时间增长逐步增加，到16h时，达到最大。
Thimerosal处理后的细胞时间-反应则展示了不同的细胞健康的影响。即使只用Thimerosal处理了很短的3个小时，绝大多数的细胞都发生了线粒体的去极化。在第3小时，Annexin V阳性细胞比例明显增加，并且在后续时间点逐渐增加。处理6小时时，才明显观察到细胞中Caspase的活性以及死亡细胞比例的增加。
图7：Jurkat细胞对gambogic acid和thimerosal，处理时间长短的反应
小结
使用easyCyte™ 12HT台式流式细胞仪进行96孔板的筛选，可轻松比较不同化合物的作用机制，加上其微毛细管上样系统的设计，可以大大节省细胞样本。此外，InCyte™软件中的热图功能，可以帮助研究者深入分析化合物对细胞健康以及细胞增殖等的影响。单细胞水平的多参数分析提供了全面而深刻的机制信息和细胞健康信息，并极大地促进了细胞活性化合物的评估。
Cytek® Guava® easyCyte™流式细胞仪
用于药物筛选的优势
✓可进行96孔板的筛选，实验通量高
✓上样细胞量少，节省样本和上机时间
✓微毛细管上样+注射泵的设计，可实现精准的绝对计数
✓无鞘液，废液少，节省处理液体的大量时间和精力
✓支持多达12个荧光通道的检测，可检测更多参数
✓支持21 CFR part 11法规，可更好地助力工业领域的应用
✓搭载的InCyte™软件支持热图分析以及IC50/EC50分析，直观的分析展示帮助快速判定筛选结果
✓支持外接机械臂等自动化设备，实现自动化分析
✓台式流式细胞仪，所需空间小
图8：Cytek® Guava® easyCyte™流式细胞仪及外接的自动化设备
关于Cytek
About Cytek /
Cytek Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球技术先的生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling™，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器 ——Aurora™和Northern Lights™分析系统、Aurora™ CS分选系统，Amnis®和Guava®品牌下的流式细胞仪和成像产品，Cytek Orion™全自动试剂预混系统，以及试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。更多的相关信息，请登录Cytek的官方网站：www.cytekbio.com和www.cytekbio.com.cn。
注：Cytek的产品仅供科研使用，不可用于临床诊断（Cytek® Northern Lights-CLC系统，DxP Athena®系统以及部分试剂除外）。
Cytek, SpectroPanel, Tonbo Biosciences, cFluor, SpectroFlo, ESP, Full Spectrum Profiling, FSP, DxP Athena, Cytek Aurora, Northern Lights, Cytek Orion, Amnis, Guava 和 ImageStream 是Cytek Biosciences, Inc.的商标。
Cytek Biosciences专利包括但不限于:US10739245B2，US11169076B2，US10788411B2，US7320775B2，US7410809B2，US8005314，US8150136，US8817115，US9528989