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公司新闻/正文
想更全面精准地检测药物遗传毒性？成像流式细胞仪助力更高效的微核检测
329 人阅读发布时间：2024-12-17 10:42
背 景
在药物筛选中，评估候选药物的基因毒性（DNA或染色体损伤）是强制要求的，其中有一项必须进行的测试是对药物作用后的体外哺乳动物细胞进行微核检测。微核（Micronucleus，MN）检测是指在细胞的有丝分裂的间期对细胞质中的微核进行检测，以评估染色质DNA损伤。高效准确的微核检测可以避免有基因毒性的药物进入下游动物实验，也可进一步避免舍弃有希望的候选药物。
检测技术
检测微核的传统方案是使用显微镜，可通过自动评分或者半自动的图像分析来进行分类，最近，使用流式检测微核的方式在被广泛采用。手动评分的方案费时费力，但是自动检测可能会存在错误的阳性或者阴性输出。因此，需要更加全面准确的体外检测方法以明确形成微核的药物作用方式。这篇文章中介绍了新的方法-利用Cytek® Amnis® ImageStream®X Mk II成像流式细胞仪来实现自动高效的微核检测。
实验方案
使用染色体断裂剂（MMS）或非整倍体毒剂（多菌灵）处理细胞后，获取细胞并对其进行固定，细胞被标记上pH3-AF488、ɣH2AX-BV421、p53-PE以及DNA染料-DRAQ5后上机进行分析。磷酸化组蛋白3（pH3）与非整倍体的出现有关，ɣH2AX与染色体的断裂有关，而肿瘤抑制蛋白p53则被用来评估DNA受损细胞的反应，结合这些生物标志物以及细胞周期的分析，可以更准确地判断微核的形成并更加全面了解到药物的基因毒性。
使用IDEAS®软件分析：
1. 微核检测
首先使用IDEAS®软件检测并定义DRAQ5核染色区域的图像，其中包含了母核以及微核（图1a-c）。随后使用“Level Set”以及“Range”等功能来定义出母核（图1d-f）。提取出母核的区域后，可确保微核处于母核所在区域之外（图1g）。为了大程度确保微核检测的灵敏度，使用不同的“Size”以及“Roundness”将微核区域的定义过程重复了三次，发现三次定义的合集基本可以囊括所有微核。使用三次定义的合集（The MN masks 1, 2 and 3）加上细胞质的区域”cytoplasma mask”可以生成最终的微核定义区域“Complete Final MN Mask”（CFM）（图1h）。
为了使微核检测自动化，应用IDEAS®软件中的“Spot Count”（点计数）功能，在健康的单核细胞群中的CFM区域上对微核进行计数。根据微核出现的频率，会生成一个直方图（图1i）。
图1 - 对微核进行定义并计数
2. 周期分析与各生物标志物的圈门
圈出DRAQ5阳性的细胞，以排除掉背景信号和碎片（图2a）。绘制直方图，展示细胞表达DRAQ5的荧光强度，从中可了解到细胞的DNA含量，进一步可揭示细胞处于有丝分裂的G1期，S期以及G2/M期的哪个阶段(图2b)。并进一步定义出pH3、ɣH2AX以及p53这些生物标志物的阴性群和阳性群。
图2 - 细胞周期分析
3. 共定位分析
IDEAS®软件中有一个特有功能是Similarity，可用来检测生物标志物与细胞核的共定位。使用该功能时，软件将绘制出直方图，直方图中横坐标轴≥1的区域中的细胞被认为标志物是表达在细胞核内的，而直方图中横坐标值<0所在区域的细胞则很大概率是标志物表达在细胞质内。使用这个功能，可以了解到pH3信号是否处于细胞核内，从图3中的图片可以明显看出当横坐标轴值为-1时，pH3的信号处于细胞质区域中。而当横坐标轴的值处于接近2的位置时，pH3的表达与细胞核的位置完全重叠，证明此时pH3处在细胞核内。
图3 - pH3与细胞核的共定位分析
结 论
在该实验中，使用Cytek® Amnis®成像流式细胞分析平台以及IDEAS®6.2软件进行单细胞的成像分析。细胞的形态特征以及pH3、ɣH2AX以及p53生物标记物的信号以及细胞周期的分析都被整合入分析中，可以了解到药物作用方式，清晰地区分出了由于MMS或多菌灵诱发的微核。随着AI分析软件的发布以及机器学习的模块引入到IDEAS®软件中，未来将会让靶标的识别和计数更加智能和准确，也会让分析变的更简单，可以更有效地助力遗传毒性的检测。
此实验设计中Cytek® Amnis® ImageStream®X Mk II成像流式细胞仪对于微核检测的优势：
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同时检测多个参数：可在保护细胞形态以及细胞完整度的情况下，检测DNA受损的药物作用方式的多种信息；
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高通量的分析：可在较短时间内定量分析大量细胞，得出具有统计学意义的分析结果；
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结果精确：对单个细胞的微核以及细胞信号进行分析，利用图像确认，保证了结果的精准度；
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圈门有据可依：借助于细胞的真实图像以及软件中的各项功能，可以有效降低传统流式圈门的主观性。
图4 - Cytek® Amnis® ImageStream®X Mk II 成像流式细胞仪
关于Cytek® Amnis® ImageStream®X Mk II成像流式细胞仪的更多介绍，欢迎访问 Cytek官方网站 进一步查阅！
参考文献：
Danielle S. G. Harte, Anthony M. Lynch, et al. A multi‑biomarker micronucleus assay using imaging flow cytometry. Archives of Toxicology. 2024
关于Cytek
About Cytek /
Cytek Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球技术先的生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling™，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器 ——Aurora™和Northern Lights™分析系统、Aurora™ CS分选系统，Amnis®和Guava®品牌下的流式细胞仪和成像产品，Cytek Orion™全自动试剂预混系统，增强小颗粒（ESP™）检测技术，以及试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。更多的相关信息，请登录Cytek的官方网站：www.cytekbio.com和www.cytekbio.com.cn。
注：Cytek的产品仅供科研使用，不可用于临床诊断（Cytek® Northern Lights-CLC系统，DxP Athena®系统以及部分试剂除外）。
Cytek, SpectroPanel, Tonbo Biosciences, cFluor, SpectroFlo, ESP, Full Spectrum Profiling, FSP, DxP Athena, Cytek Aurora, Northern Lights, Cytek Orion, Amnis, Guava 和 ImageStream 是Cytek Biosciences, Inc.的商标。
Cytek Biosciences专利包括但不限于:US10739245B2，US11169076B2，US10788411B2，US7320775B2，US7410809B2，US8005314，US8150136，US8817115，US9528989