拨开云雾，看见夜空中最亮的星--领略全光谱流式自发荧光提取风采

自发荧光（Autofluorescence，AF）顾名思义，即细胞自身发出的荧光，荧光强度会随着细胞大小、颗粒度、代谢状态或者实验条件等发生改变。对于传统流式来说，自发荧光往往是让研究人员束手无策的难题，甚至还会带来迷惑结果的误判。全光谱流式细胞仪的问世，突破了传统流式的实验瓶颈，打开了全局视野，看清了发射光谱全貌，包括对于自发荧光的光谱也能一目了然，提取自发荧光的特色功能让细胞的阳性信号从背景中脱颖而出。

自发荧光来源于细胞中的结构蛋白如胶原蛋白和弹性蛋白、细胞器如溶酶体和线粒体、代谢物如环状化合物和芳香氨基酸等，大部分的AF发射光集中在短波长光谱区域，荧光的强度会随着生理、病理和实验条件发生变化。 

传统流式一般通过优化样本制备或者选择长波长的荧光素，可以适当避开自发荧光带来的背景干扰，但是很多时候并没有真正解决这个问题；采用全光谱流式细胞仪提取自发荧光的功能，能够给背景荧光“降噪”，让真阳性从背景中脱颖而出；看清了自发荧光光谱，还能“化腐朽为神奇”，免抗体标记直接利用自发荧光分析目的细胞。

Cytek^® Aurora™全光谱流式细胞仪搭载专利的全光谱分析（Full Spectrum Profilling，FSP™）技术，配置5激光67个检测器，广泛兼容市售荧光试剂选择，荧光发射光谱完整信息一览无余，也让流式识别细胞自发荧光指纹图谱照进现实。

不同细胞或组织会呈现出形状各异的自发荧光指纹图谱，例如红细胞小并且结构简单，对应的自发荧光强度就非常低；肺泡巨噬细胞SSC较大，细胞颗粒复杂，对应的高自发荧光就容易与真阳性的光谱混淆。

对于海洋生物，不同种属之间可以通过自发荧光光谱实现免标记区分，这样可以利用自发荧光标签从海洋生物样本中鉴定和筛选特定的种属。

有的样品自发荧光不仅仅是上述的单一一种光谱，例如人外周血样品中的粒、单核、淋巴细胞，自发荧光亮度存在差异，光谱归一化拟合之后，单核与淋巴细胞的自发荧光形状相似，但粒细胞则与之不同。

面对高自发荧光带来的困扰，全光谱流式细胞仪可以基于识别到的自发荧光光谱，在数据解析时，一键勾选提取自发荧光，改善检测的分辨率。示例中采用的是PBMC冻干粉试剂盒，自发荧光偏高，对于方案中位于短波长发射光的荧光素会有较大背景干扰，提取自发荧光前后分辨率呈现显著性差异。

不同的样品对应采取不同的自发荧光提取策略，其中第3种情况的样本最为复杂。

第一种场景，从FSC/SSC散点图中只看到一群细胞，阴性细胞光谱集中，说明属于同质性的样品。例如诱导多能干细胞转染表达GFP荧光蛋白，未提取自发荧光解析时阴阳性群挨在一起，影响圈门，而勾选提取自发荧光之后，细胞群分辨率明显改善。

第二种场景，当异质性样品自发荧光光谱相似但亮度不同时，阴性细胞的光谱相对会分散，但光谱归一化拟合之后形状几乎重合，此时挑选其中代表性的一群提取自发荧光即可。

第三种场景，面对异质性样本亮度和光谱都有差异的情况。在阴性对照和多标样本中，排除黏连体、碎片和死细胞干扰后，提取自发荧光解析，能够同步观察到图示对角线的异常细胞群，初步证明存在不止一种自发荧光的干扰。

Cytek^®全光谱流式细胞仪可以实现多重自发荧光提取，首先从散射光信号中依次查看对应亚群的光谱，再细分为4群（高SSC中存在2种光谱），观察到其中有一群高SSC的细胞自发荧光与其他亚群不同。软件借助相似指数定量对比4群细胞AF光谱之间的相似程度，再次证明HighSSC-HiV15的确与其他光谱形状不同。 

按照上述策略定位到干扰结果的AF标签后，将其作为新的荧光素标签加入到方案中进行解析，同时勾选提取自发荧光，多标管中对角线那群就神奇地消失了。

Cytek^®全光谱分析型流式细胞仪新版软件中，多重自发荧光提取的策略已被整合在Autofluorescence (AF) Explorer新功能中，操作人员仅需一键式点击，即可自动化完成异质性自发荧光识别和提取，带来更客观、真实、准确的数据分析结果，自发荧光难题迎刃而解。