Cytek® Amnis®量化成像流式细胞技术应用——多种类型的细菌检测

大肠杆菌、沙门氏菌或其他细菌污染粮食储备物是全世界面临的一个挑战，可能会引起严重的疾病或导致死亡。苜蓿种子芽生长在温暖潮湿的环境中，这也同样是沙门氏菌理想的生长条件，因此需定期进行污染监测。FISH探针中使用的寡核苷酸可以快速、高度特异地检测沙门氏菌。在本实验中，使用沙门氏菌特异性FISH探针（使用荧光素酰胺，也称为FAM），结合荧光/侧向散射光信号测量和门控群体的形态学确认，在苜蓿种子芽制剂中鉴定是否有沙门氏菌的污染（Fig 1）。

Fig 1：在芽制剂中鉴定沙门氏菌。采用强FAM荧光和低SSC圈选苜蓿芽制剂中结合FISH探针（FAM）的沙门氏菌。右图为代表性图像。

蓝藻是一种光合作用的原核生物，参与了多种全球的生物地球化学循环。具备不同形态的物种，以单细胞、克隆和丝状形态生长。Cytek^® Amnis^® ImageStream^®X Mk II成像流式细胞仪不仅可以检测细胞形态，还可以表征叶绿体自发荧光和鉴别单、双、三个丝状细胞（Fig 2），并能定量统计丝状蓝藻细胞的长度（Fig 3）。

Fig 2：鉴定单个丝状蓝藻。分析培养的蓝藻，在叶绿素自发荧光通道中用一个连续的mask（称为“spot”），利用点计数通道5（Ch5）的图鉴定单个细菌。上方图像显示了一、二、三个蓝藻。

Fig 3：单个丝状蓝藻的长度分布。直方图显示蓝藻在静息群体（左图）和丝状生长培养基的细胞（右图）中的长度分布。不同长度的群体的图像如上所示。

当细胞持续生长而不分裂时，大肠杆菌菌株的异常丝化就会发生，这意味着细菌有能力逃逸先天免疫反应。这些长丝可以保护细菌免受中性粒细胞的吞噬，增进细菌的毒力。这个例子中展示了如何用Cytek^®Amnis^® Image-Stream^®X Mk II系统来测量各种尺寸的大肠杆菌长度和表征大肠杆菌丝状形成（Fig 4）。

Fig 4：单个丝状大肠杆菌的长度分布。表达绿色荧光蛋白（GFP）的大肠杆菌样本在诱导成丝的条件下培养，采用Cytek^®Amnis^® ImageStream^®X Mk II获取结果。鉴定单个细菌，并基于Amnis^® IDEAS^®软件的长度功能测量单个细菌。直方图展示了培养物的长度分布，对应1-2 μm, 10-20 μm, and 20 μm+群体的图像如上所示。

持留菌（Persister cells）是能够抵抗致死剂量抗生素的细菌，其生长缓慢或受阻。当撤去抗生素后，这些细菌会复苏，其与慢性感染和感染复发有关，并且抗生素的抵抗对于人类的健康威胁极大，因此持留菌形成的机制是细菌学界研究重点。在本实验中，使用Cytek^® Amnis^® ImageStream^®X Mk II成像流式细胞分析仪，来检测大肠杆菌中的持留菌（Fig 5）。

Fig 5：大肠杆菌中持留菌组的检测。死去的细菌可被PI标记，而持留菌组还属于活细菌，不能被PI 标记，因此用于检测PI的Ch05通道无荧光信号。此外持留菌组一般小于2μm，在明场中可观察并测得细菌的长度。而且由于持留菌组具有活性，因此细菌内各类细胞器结构完整，所以可呈现出高强度的SSC信号。因此可鉴定用抗生素处理大肠杆菌后的持留菌组。

在巨噬细胞吞噬细菌后，测出在抗生素作用下，细菌在巨噬细胞内的增殖情况是评估不同药物对于细菌感染抑制作用的有效方式。在下述实验中，Cytek^® Amnis^® ImageStream^®X Mk II成像流式细胞分析仪不仅可检测出THP-1细胞中的细菌，同时还利用IDEAS^®软件中强大的分析功能，对抗生素处理后宿主细胞内的细菌进行计数，以比较不同时间点THP-1细胞中细菌的数量，以明确细菌在细胞体内是否增殖并评估抗生素的作用效果（Fig 6）。

Fig6: 检测THP-1细胞中的细菌及其数量。左上图中CD63（红色荧光）用于标记THP-1细胞，绿色荧光是表达GFP的分歧杆菌H37Ra，从图片中清晰辨别出绿色的点并计算其数量；右上图是利用IDEAS软件统计出每个THP-1细胞中的细菌数。折线图为比较不同时间点，使用抗生素处理和不使用抗生素处理的平均每个THP-1细胞中的细菌数量。