硬核流式操作指南：全光谱流式精细化分析小鼠“大脑卫士”--小胶质细胞

小胶质细胞是大脑中免疫细胞的主角，扮演着碎片吞噬、神经元支持和突触修剪等重要功能，与阿尔兹海默病（AD）等神经系统疾病的发生息息相关。小胶质细胞的不同亚群在神经系统微环境中各司其职，虽然使用荧光显微镜可以对其表型进行区分，但是存在耗时长、通量低、主观性强等局限性；通过单细胞测序平台可以实现高维分析，但是成本高、数据分析技术门槛较高，也限制了该应用的普及。来自美国俄克拉荷马大学健康科学中心的研究人员，基于Cytek^® Aurora™全光谱分析型流式细胞仪，建立了高通量、简便易用且实现小胶质细胞精细化分型的完整解决方案。这一方案可以扩展加入更多标志物，也可以延伸应用到不同的组织、疾病类型，还可以无缝衔接全光谱分选型流式细胞仪，分选感兴趣的细胞并对接下游功能性实验。

图1 – 全光谱流式细胞仪检测小胶质细胞完整流程¹

配置组织消化酶：Enzyme Mix 1: Buffer Z (1,900 μL/样品) + Enzyme P (50 μL/样品)；Enzyme Mix 2: Buffer Y (20 μL/样品) + Enzyme A (100 μL/样品)。

将1,950 μL Enzyme Mix 1加入到gentleMACS C 管中，并补充2 μL转录和翻译抑制剂，防止小胶质细胞体外活化。

冰上解剖分离小鼠海马体，分为4份，放入gentleMACS C 管中，每管中加入30 μL Enzyme Mix 2。

将C管放置在组织处理仪器上（美天旎），确保组织全部浸没在缓冲液中，选择程序37C_ABDK_02。

程序结束后，取下C管，使用提前冷却到4 ℃的离心机300 g速离，弃上清，D-PBS重悬后，70 μm MACS SmartStrainer 筛网过滤，转移到15 mL离心管中。

300 g 4 ℃离心10 min，弃上清，用1,550 μL D-PBS重悬，并转移到5 mL流式管中。

加入450 μL Debris Removal Solution，用移液器轻柔吹吸，充分混匀，再缓慢加入2 mL D-PBS覆盖层，注意各层之间不相混合。

3000 g 4 ℃离心10 min，流式管中缓冲液会分成3层，吸走第1和2层。

用D-PBS将体积补到5mL，盖紧盖子后，颠倒3次充分混匀。1000 g 4 ℃离心10 min，弃上清。

取1 mL染色缓冲液重悬细胞，吸取100 μL细胞悬液，过滤到新的流式管中。

300 g 4 ℃离心10 min，弃上清，残留大约30 μL缓冲液。取50 μL Fc 受体阻断剂（1:200稀释，1 μL TruStain FcX + 199 μL 染色缓冲液）重悬细胞，室温避光孵育5 min。

每管用20 μL染色缓冲液重悬至终体积为100 μL。

单标管和多标管分别加入对应的抗体，4 ℃避光孵育30 min。

使用1 mL染色缓冲液清洗，300 g，4 ℃离心10 min。

弃上清，250 μL缓冲液重悬细胞，上机检测。

1.采用5激光Cytek^® Aurora™全光谱分析型流式细胞仪采集样本并分析数据，由于小鼠大脑组织自发荧光很高，数据分析时需要在软件中勾选提取自发荧光的功能。

2.采用FSC/SSC排除碎片，圈选目的细胞，FSC-A/FSC-H排除黏连体干扰，从AF-群体中，基于经典指标CD11b+CD45^Mid识别出小胶质细胞。

图4 - 小胶质细胞门控策略

3.根据标志物的表达情况，可以将小胶质细胞细分为以下四群：

稳态小胶质细胞（P2RY12+CLEC7A-）

疾病相关小胶质细胞DAM（CD11c^highCLEC7A^high和/或CD282+CLEC7A^high）

干扰素反应性小胶质细胞IRM（CD371+）

脂滴聚集的小胶质细胞LDAM（CD63+）

图5 – 小胶质细胞细分为四群

在另一篇文章中，这一实验方案得到了重现²。研究人员发现，不同年龄与性别的小鼠海马体中的小胶质细胞存在丰度差异，其中，DAM的比例在年老雌性小鼠中显著性升高（图6F），稳态小胶质细胞比例与年龄关系不大，但是年老雄性小鼠比年老雌性小鼠比例更高（图6G），IRM比例受小鼠年龄影响较大（图6H），LDAM跟DAM情况类似，在年老雌性小鼠中比例更高（图6I）。在衰老小鼠的海马体中，雌性小鼠的小胶质细胞呈现出疾病相关与衰老的表型，这个现象解释了在神经性疾病--阿尔兹海默症患者中，疾病易感性和疾病进展存在性别差异，其背后可能存在的免疫证据。

图6 – 不同年龄与性别小鼠的小胶质细胞的丰度差异