轻松驾驭35种自发荧光！多重自发荧光提取让异质性组织样品一键“降噪”

自发荧光（Autofluorescence，AF）是指由内源性细胞成分发出的任何荧光，其来源包括细胞中的结构蛋白（如胶原蛋白和弹性蛋白）、细胞器（如溶酶体和线粒体）、代谢物（如NAD (P) H和色氨酸）等。针对高自发荧光样本，Cytek全光谱流式细胞仪可以将自发荧光作为一种独立光谱进行解析，扣除背景干扰，提升检测分辨率；而对于更为复杂的异质性自发荧光样本，Cytek软件的Autofluorescence (AF) Explorer功能能够引导式完成多重自发荧光的识别和提取（本文引用的研究解锁了多达35种AF提取），通过严谨可视化的数据质控，一键破解自发荧光的难题。

图1 – Cytek AF提取让数据分辨率实现质的飞跃

巴塞尔大学医院生物医学系教授、国际乳腺癌基础与转化研究领域领军学者Mohamed Bentires-Alj所在研究团队，开发了小鼠肺部的30参数精细免疫表征方案，方案包含27种荧光指标与3种自发荧光光谱（筛选自35种肺部自发荧光），并将其应用于两种乳腺癌肺转移模型的监测评估。

图2 – 开发30参数小鼠肺部精细免疫表征方案¹

研究人员针对乳腺癌发生肺转移前、转移进程中的小鼠开展精细化表型分析，以追踪免疫细胞亚群及其活化或抑制状态的动态演变。研究人员纳入了17类肺部主要的免疫细胞亚群，开发了包含26个标志物与1个活性染料，共计27色的小鼠乳腺癌肺转移的精细免疫分型全光谱流式方案。

图3 – 方案涉及的小鼠肺部免疫细胞亚群与标志物

小鼠肺部细胞是一类高自发荧光且高度异质性的样本，研究人员通过Cytek Aurora™全光谱流式细胞仪进行数据采集，并从未染肺部样本中识别并提取出35种自发荧光光谱，排除相似指数高的组别后，筛选出共计12种独特的AF光谱。随后，将这12种AF光谱加入到27色方案中进行解析，剔除掉其中无法提升解析精度、或者引入误差造成数据失真的AF，最终确定AF 5、13、35这3种AF光谱应用于方案解析，组成30参数的小鼠肺部免疫表征方案。其中AF13与从支气管肺泡灌洗液分离得到的肺泡巨噬细胞（AMØs）的自发荧光光谱高度相似，肺部驻留AMØs是已知的小鼠所有驻留巨噬细胞中自发荧光最强的一类。多重自发荧光提取，让高度异质性的肺部免疫微环境分析的数据分辨率实现了质的飞跃。

图4 – 小鼠肺部细胞多重自发荧光提取鉴定

小鼠肺部30参数方案覆盖固有免疫与适应性免疫的主要细胞亚群，主要亚群与标志物如下：

图5 – 小鼠肺部30参数方案门控策略

Cytek全光谱流式细胞仪软件将多重自发荧光提取步骤集成至Autofluorescence (AF) Explorer，可针对异质性样本一键“降噪”，让高自发荧光样品的数据质量实现质的飞跃；还可实现无标记实验，让自发荧光“变废为宝”，无需任何荧光抗体标记仅通过自发荧光光谱特征即可锁定感兴趣亚群；值得一提的是，Cytek Aurora CS全光谱分选型流式细胞仪同样配置该功能，上述表染30参数方案，可“丝滑”平移到Cytek Aurora CS分选仪上实现感兴趣亚群的分选。

图6 – Cytek FSP™平台

均搭载Autofluorescence (AF) Explorer功能